BT蛋白

Bt蛋白

Bt蛋白，BT学名是苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)，属于革兰氏阳性细菌，是世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂。BT蛋白则是BT产生的蛋白质，注意与BT区别。

研究历史

苏云金杆菌发现有上百年的历史：

1901年日本人石渡(Ishiwata)从病蚕尸体中分离出一株所谓碎倒细菌(sotto. bacteria)。

1911年Ernst Berliner在德国苏云金(Thuringia)的一个面粉厂的地中海粉斑螟(Anagasta Ruchniela)患病幼虫中又分离到这种产伴孢晶体的芽孢杆菌。

1915年定名为苏云金芽孢杆菌，一般称苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis Berliner)。Ernst Berliner指明苏云金杆菌含有伴胞晶体(parasporal Crystal)，但未曾说明苏云金杆菌的孢晶体有杀虫作用。

从1920年到1950年这一段时期内，有许多人曾用苏云金杆菌进行防治害虫的田间试验。

1956年Angus证实杀虫活性物质位于伴孢晶体之中。他将伴孢晶体与孢子分开之后，单独伴孢晶体仍然存在杀虫活性，证明了苏云金芽孢杆菌中的伴孢晶体蛋白是杀虫活性的主要来源。

苏云金芽孢杆菌大多数菌株都能产生多种类型的伴孢晶体蛋白(parasporal crystal protein)，即δ一内毒素或杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Protein, ICP)对鳞翅目(Lepidopera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleopter)、膜翅目(Hymenoptera)、半翅目（Hemiptera）、直翅目(Orthoptera) 、食毛目(M allophaga)等多种昆虫，以及线虫、蜡类和原生动物等具有特异性的杀虫活性。迄今为止，已分离测定了100多个杀虫晶体蛋白基因序列, Bt基因已成为植物基因工程及转基因育种中应用最广泛，最具潜力和应用前景的抗虫基因。

近年来，不断发现的杀虫晶体蛋白及其基因使得原先分类系统中的氨基酸序列与杀虫活性间产生了不协调性，而且随着新基因的发现，这种分类方法越来越不能满足这两个条件，使得分类难以确定。Crickmore等在1995年国际无脊椎动物病理学会年会(SIP)上提出了以杀虫晶体蛋白氨基酸序列的同源性为唯一依据区别Bt基因的新分类系统，现已被各国广泛采纳。同源性在45%以下，为第一等级，用阿拉伯数字表示;同源性在45%-78%之间，为第二等级，用大写英文字母表示;同源性在78%-95%之间，为第三等级，用小写英文字母表示;同源性在95%以上，为第四等级，用阿拉伯数字表示。只要满足来自Bt的伴抱包涵体(晶体)，与已知的cry或cyt具有高的同源性，就可以纳入这个系统。

2004年1月已经发现299种杀虫晶体蛋白基因，分属于44群(其中cry基因42群，cyt基因2群),136模式基因。

杀虫晶体蛋白基因在Bt中的分布现在发现的116个杀虫蛋白基因，分别分布于Bt不同菌株中。不同血清型、不同亚种之间，其基因数和种类有明显差异，1-6个不等。同一菌株的杀虫晶体蛋白基因，也可能定位于不同的质粒上；或者多个晶体蛋白基因定位于同一质粒上；而有的则定位于染色体上同一杀虫晶体蛋白基因在不同的菌株中可定位于不同的质粒上，即使在同一菌株中的同一杀虫晶体蛋白基因也可定位于不同的质粒上，甚至有的菌株的同一杀虫晶体蛋白基因可同时定位于质粒和染色体上。

争议

不过，另外一些人对Bt蛋白无毒性表示谨慎态度，一些实验表明，Bt蛋白能激发黄河鲤鱼的免疫系统，这说明BT蛋白可以影响脊椎动物的免疫系统（殷海成，苏云金芽孢杆菌对黄河鲤白细胞吞噬和溶菌酶活性的影响。河南农业科学, 2009年 04期）。

并且，更为有力的证据是，实验表明，某些菌株（Bt9875）生产的BT蛋白可以导致HL-60等人类细胞的凋亡（竺利红，等。苏云金芽孢杆菌Bt9875晶体蛋白诱导HL-60细胞凋亡。微生物学报Acta Microbiologica Sinica 48(5)：690~694;4 May 2008）。这充分证明了，BT蛋白对人类是存在着潜在毒性的。

同时，人们对Bt蛋白热稳实验表示怀疑，由于Bt蛋白有很多子类，在热稳实验中，并未提交所有的Bt蛋白子类都进行热稳实验，至少转基因玉米中的一种Bt蛋白Cry9C，能够在90摄氏度高温持续120分钟而不降解，如果这种蛋白存在潜在危险，那么海拔高于3000米的居民将受到广泛的影响。

这说明，对BT蛋白的安全性评估是不严谨的，或许，重新评估BT蛋白的安全性，是完全有必要的。

分布

多态性

Bt质粒的多态性

Bt菌中普遍有质粒存在，但不同菌株质粒的数量和大小各不相同，表明了Bt质粒的多态性根据质粒的大小和特性，可将Bt质粒分为2种类型: Ⅰ型为小质粒，分子量小于15MDa，相互之间及与大质粒和染色体都无同源性，其功能不详；Ⅱ型为大质粒，分子量大于15MD，相互之间及与染色体间存在序列的同源性，在菌株间可通过接合方式转移，大多数杀虫晶体蛋白基因定位于这类质粒上。Bt不同亚种质粒数是不同的，并非任何一种质粒在所有亚种中都存在，不同亚种质粒数及大小不同，而且同一亚种不同来源的菌株，质粒数及大小也不一致，这充分反映了Bt质粒的多态性。

多样性

Bt核基因的多样性和保守性

DNAG+Cmol%是细菌分类的重要指标之一，它反映了DNA链中不同类型的碱基的相对比例。一般细菌种内个体间DNAG+Cmol%的差异不超过3%，属内种间不超过10%；细菌群体内变化为24%-76%。Bt的G+Cmol%变化范围在35.7%-37%，表明Bt群体中不同菌株DNAG+Cmol%组成仍存在一定异，表现出其基因组CE.碱基组成的丰富多样性同时，利用DNA-DNA分子杂交分析可有效分析其不同来源菌株DNA碱基顺序同源性，实验证明：Bt作为一个种DNA同源性达60%以上，表现出Bt基因组DNA的稳定性和保守性。

优缺点

虽然Bt蛋白有很多优点，但是Bt作为生物农药的缺陷也很明显。首先，它的价格很贵。其次，它在自然环境中很不稳定。作为喷洒剂，Bt农药很容易被雨水冲走，在紫外线的照射下也很快被分解。这就意味着农民需要多次喷洒Bt杀虫剂，不仅麻烦，而且进一步提高了成本。随着更加便宜的化学合成杀虫剂的出现，Bt农药在市场上的份额大幅度下降，只有那些坚持用有机绿色方式种植作物的农民才会使用它。不过合成杀虫剂对环境造成了很大的破坏，而且还威胁到了人类自身的健康。所以如何改进更加环保的生物农药，让它们变得便宜、稳定，成了一个棘手却重要的问题。

这个问题的解决，得益于现代生物技术的诞生。20世纪50中期，科学家发现Bt蛋白对鳞翅目动物的毒性来自孢子形成过程中产生的晶体蛋白质。1981年，Schnepf HE 和 Whiteley HR成功地提纯了这种蛋白质并命名为cry。随后他们克隆出了cry的基因。几年以后，美国的科学家把Bt蛋白的基因转入玉米和棉花中，让它在植物中持续地表达出来。这样，就不需要人工喷洒Bt蛋白了。转基因技术和传统的杂交育种技术并无本质的区别，但是它的可控性更好。打个比方，如果说传统的杂交育种是盲目地将大量基因像一团乱麻一样塞入新品种的话，那么转基因技术更像一把锋利的手术刀，能够精准地切割我们需要的基因，然后把它接入新作物中。这样，培育新品种作物的不确定性就大大降低了。Bt转基因作物的出现还有一个好处，因为Bt蛋白更加集中地出现在植物体内，所以误伤非农业害虫的几率变低了不少。经过了10年的检验后，1996年，转基因玉米和棉花在美国成功地上市。从那时算起也已经有十多年了，还没有发现对人类健康有任何负面的影响。Bt转基因作物对于环境的贡献是巨大的。在美国，转基因抗虫棉让杀虫剂的使用量降低了82%。而在中国，转基因棉的种植也让叶农药的使用量降低了60%-80%。

评价

近来，有关对转基因植物的商品化是否会导致严重的环境问题已经引起各方激烈的辩论，各方主要涉及的问题是转基因植物的广泛种植与传播是否会加速不合需要杂草及抗农药昆虫的进化。许多研究资料表明，经遗传改良植物的商品化会导致编码有利性状的转基因转移到这些植物的野生种和近缘种中。而且与目的基因紧密连锁的标记基因或报告基因同样存在一定的风险性。Allison等认为Bt杀虫晶体蛋白杀虫活性的散失将可能成为转Bt基因植物产生的最严重的生态危机。有关转Bt基因植物潜在的生态危险性，已引起生态学家、生物学家和农学家们的密切关注，这方面的研究已成为热点。世界各国相继制定颁布了一系列生物遗传工程体及其产品安全性评价条例，对转基因植物的安全性作出了严格的评价标准。有关转基因植物对生态环境和食物安全性的影响已进行了不少研究，积累了一大批有价值的资料。从己商品化的转Bt基因植物来看，还没有关于其对生态环境产生危险性的报道，但是，转Bt基因植物潜在的风险性必须引起重视。

转基因沉默

转Bt杀虫晶体蛋白基因的沉默

限制转基因植物向商品化、实用化方向发展的另一个重要因素是转基因的沉默(gene silenclng)现象。发现转CryIA (b)Bt的转基因水稻中Cry1A(b)转基因的沉默现象，转基因的沉默与转基因在受体植物中甲基化状况、转基因的拷贝数、插人受体植物染色体位点及转基因是否与受体植物中有同源基因等因素有关。通过筛选单拷贝转基因个体，采用特殊功能的启动子和增强子，选用新的转基因方法，如构建细胞核基质支架附着区载体等可以有效地防止转基因的沉默。

性状变异

转Bt基因植物的性状变异

不少文献报道了转基因植物会产生一系列性状变异。Lynch等报道了转基因水稻表现出植株变小，花期推迟，育性降低等变异。发现:转cry1A(b),cry7A(c) Bt基因的水稻在温室及田间生长条件下，与对照相比，转基因水稻株系在株高、穗长、单株粒重、百粒重和结实率等方面都显著降低，而单株有效分孽数增多，生育期推迟，落粒性增强。转基因植物性状变化除了由无性变异引起外，还由于外源基因的导人破坏了受体基因的活性，影响了受体植物的代谢过程，使表型发生了改变。所以在进行转Bt杀虫晶体蛋白基因育种时，根据育种目标，选择优良表型且具较强杀虫活性的转基因植物，并积极辅助以杂交、回交、理化诱变、组织培养等育种手段，对于创造出具优良性状的抗虫植物至关重要。

转Bt基因植物的出现已经为现代农业发展开创了一个新时代，但它仅仅是增加产量，带来持续农业，保护生态环境的一系列新的安全技术的一个开端，将来仍必须开展如何合理和持续利用Bt以及如何使转Bt基因植物与传统农业相结合的研究，同时注重解决转Bt基因植物中存在的问题，使转Bt基因植物更好地服务于人类

论证

人类使用Bt的历史已经有大半个世纪了。在此期间，科学家做了数不清的实验评估Bt中cry蛋白的安全性。检验一种物质是否有毒，最直接的方法就是急性经口毒性检测。科学家用纯的Bt蛋白在老鼠身上做实验。对于老鼠来说，按照每千克体重口服3.8-5g cry蛋白的量是安全的。中国的转基因水稻中Bt蛋白含量不超过2.5微克/g，所以一个60kg的人吃120吨稻米也不会因为cry蛋白中毒。另一方面，Bt蛋白在人体内不能积累。如果把它加入胃液提取物中，所有的Bt蛋白会在0-7分钟内被分解，这是一种容易消化的蛋白质。而且它包含了全部的人体必需氨基酸。所以对人类来说，Bt蛋白不但没有毒性，反而还挺有营养。

对Bt蛋白的毒理研究显示，Bt蛋白本身是无毒的，是一种原毒素。这种原毒素可以被某些昆虫体内的酶活化，随后能够结合在肠道的受体上，造成肠道穿孔。人类和绝大多数动物既没有可以激活原毒素的蛋白酶，也不存在能和Bt蛋白特异性结合的受体，所以Bt蛋白质对人类的健康没有任何影响。很多人对Bt蛋白的恐惧来源于“虫吃了要死，人吃了怎样”的担忧。这种担忧毫无道理，人类和昆虫本来就是完全不同的物种。番茄碱，辣椒素都能杀虫，但是并不妨碍番茄和辣椒成为人们喜爱的食物。

还有一些人担心Bt蛋白会成为一种过敏原，这种担心也是不必要的。Bt蛋白在氨基酸序列和蛋白质结构上都和人类已知的过敏原相差很大，而且没有任何实验证据说明它能够引起过敏反应。美国自上世纪50年代开始大规模使用Bt蛋白作为生物农药，迄今为止只发现了两例有争议的过敏案例。其中一人有严重的食物过敏症，所以不能确定过敏原一定是Bt蛋白----就算是Bt蛋白，也不能说明什么，要知道美国每年因为花生过敏死亡的人数就有约100人。

一些新的cry蛋白也成功地从Bt中分离出来，它们可以杀灭不同的昆虫种类，但是都具有特异度高的特点。某些cry蛋白可以抗鞘翅目昆虫。土豆的头号杀手科罗拉多甲虫以及我国的重要的用材树种杨树的天敌天牛都属于鞘翅目。另外一些cry蛋白则针对双翅目昆虫。虽然双翅目昆虫大多不是农业害虫，但是它们能传染疾病。蟠尾丝虫症（Onchocerciasis）又叫河盲症（River Blindness），是仅此于沙眼之后的第二大致盲传染病。河盲症由一种叫做黑蝇的双翅目动物传播，一度在非洲非常流行。1974年开始，联合国卫生组织开展了蟠尾丝虫症控制计划（OCP）,这一计划大量的使用Bt扑灭黑蝇。1985年以来，每年的Bt用量都在21万升至40万升之间。OCP计划最后大获成功，3000万人得到了保护。据估计，因为OCP计划直接避免盲眼的人数就有26万5千人。Bt作为控制疾病最主要的因素之一，功不可没。

大自然不是为了人类而设计的。自从1万年前最原始的农业产生以后，人类就开始逐渐将天然的野生植物改造成适合人类食用的作物。开始是通过无意识的人工选择。上世纪产生的诱变育种和杂交育种技术让我们能够人为的改变作物的基因组。不过这种改变是随机的，掺杂了很多不定因素。转基因技术的诞生让人类能够更有效地使作物符合自己的需要。纵观人类历史，科学技术一再帮助我们提高了生活质量，延长了平均寿命。任何以“回归自然”为借口而反对现代技术应用的行为都是反智的。正是因为无数代人努力地改造这自然中野生的物种，我们货架上的食品才会越来越丰富，越来越可口，越来越健康，越来越安全。

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