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毛细管电泳色谱法

微分离分析技术

毛细管电泳色谱法（capillary electrochromatography; CEC）是毛细管电泳与液相色谱相结合形成的一种高效、快速微分离分析技术。毛细管电泳色谱法可以分离离子和中性分子。它是利用缓冲溶液的电渗流作为泵，使被分析的分子通过对其具有不同保留程度的第二相，达到分离的目的。

基本概念
电泳（electrophoresis）是指溶液中带电粒子在电场作用下发生迁移的电动现象。
毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）是利用被分析离子在电场作用下移动的速率不同而达到分离的目的，这种技术主要用来分析在毛细管缓冲溶液中能离解为离子的物质。
毛细管电泳是一类以高压直流电场为驱动力，毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异而实现分离的新型液相分离分析技术。
毛细管电泳是分析科学中继高效液相色谱之后的又一重大进展，它使分析科学从微升水平得以进入纳升水平，并使单细胞分析成为可能。
毛细管电泳色谱法是毛细管电泳与高效液相色谱（HPLC）的有机结合，其基本理论、仪器装置与毛细管电泳大致类似。最大的不同是毛细管柱引入了色谱固定相，使CEC同时具有CE与HPLC的分离机理，对中性物质和荷电物质都能达到理想的分离效果。
优缺点
优点：操作简单，试样量少，分离效率高，成本低等。
分离能力强，分离速度快，进样量小。
像高效液相色谱，能够分离不带电荷的物质。
像毛细管电泳法，不需要压力泵系统的情况下，提供了微量体积试样溶液的高效分离通过电渗流泵，而不是通过机械输送流动相通过固定相的。
明显地简化了输送体系。
电渗泵产生的是塞子式流动轮廓，而不是流体动力学轮廓，因此毛细管电色谱的分离柱效比高效液相色 谱法高。
缺点：在迁移时间上的重现性，进样的准确性和检测灵敏度方面比高效液相色谱法稍逊。
基本理论
电泳
在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同的速度或速率向其所带电荷相反电场方向迁移的现象叫作电泳。阴离子向正极方向迁移，阳离子向负极方向迁移，中性化合物不带电荷，不发生电泳运动。
电渗流
在电泳过程中还存在另一种电动现象，即电渗。当高电压通过含有缓冲溶液的毛细管柱时，体相溶液整体朝向一个方向运动，产生电渗流。在柱内层氧化硅与溶质的界面上形成双电层是电渗流产生的原因。
在典型的毛细管电泳分离中，若有电渗存在，离子的洗脱顺序是: 首先是最快的阳离子，紧接着是依次减慢的阳离子，然后是全部的中性分子在一个区域出现，最后是最慢的阴离子，紧接着的是依次加快的阴离子。
电渗是CE的基本现象之一，它可以控制组分的迁移速率和方向，进而影响CE的分离效率和重现性，所以电渗流控制是CE中的关键问题或技术之一。
影响电渗流的因素很多，直接影响因素有：
1. 电场强度
2. 温度
3. pH值
4. 缓冲液溶剂
5. 离子强度
6. 添加剂
7.管壁涂层
分离原理
电泳和电渗流并存，在不考虑相互作用的前提下，粒子在毛细管内电介质中的迁移速率是两种速率的矢量和，在典型的毛细管电泳分离中，溶质的分离基于溶质间电泳速率的差异。电渗流的速率绝对值一般大于粒子的电泳速率，并有效地成为毛细管电泳的驱动力。溶质从毛细管的正极端进样，带正电的粒子最先流出，中性粒子次之，带负电的粒子在中性粒子之后流出。溶质依次通过检测器，得到与色谱图极为相似的电泳分离图谱。
毛细管电色谱由于引入了色谱机制，其保留机理包括两个方面：
其一，如同HPLC，基于溶质在固定相和流动间分配过程；
其二，如同CE，基于溶质电迁移过程。
由于CEC既能分离电中性溶质，又能分离带电溶质，对复杂的混合样品显示出强大的分离潜力。
两种装置
毛细管电泳和电色谱仪器装置
仪器基本结构
一般在一根长 40 ~ 100 cm, 内径 10 ~ 100 mm 的毛细管柱中充入缓冲溶液，柱的两端置于两个缓冲池中。在两个缓冲池之间的毛细管接有两个铂电极。试样从一端进入，而检测器则在另一端。使用的高电压可以反相，以能分析阴离子。
进样系统
毛细管分离通道十分细小，整个柱体积一般只有4~5μL，所需的样品区带只有几纳升。
毛细管电泳的进样方式一般是将毛细管的一端从缓冲液移出，放入试样瓶中，使毛细管直接与样品接触，然后由重力、电场力或其他动力来驱动样品流入管中。进样量可以通过控制驱动力的大小或时间长短来控制。CE进样技术均适用于CEC。
一般的进样方式是电动进样和压力进样。
电动进样是将毛细管柱的一端及其相应端的电极从缓冲池中移出，放入试样杯中，然后在一准确时间范围内施加压力，使试样因离子移动和电渗流进入毛细管柱。
压力进样是用压差使试样溶液进入毛细管。产生压差的办法可以采用在检测器端抽真空，或者通过提高试样端液面。
电源及其回路
电流回路系统包括高压电源、电极、电极槽、导线和电解质缓冲溶液等。CE和CEC一般采用0 ~ ±30 kV连续可调的直流高压电源。理想的电源应具备：
1.能输出单极直流高压(一端接地)；
2.电压、电流、功率输出模式任意可选；
3.能控制电压、电流或电功率的梯度；
4.电压输出精度应高于1%。
CE的电极通常由直径0.5~1 mm的铂丝制成。
电极槽，即缓冲液瓶，通常是带螺口的小玻璃瓶或塑料瓶(1~5 mL不等)，要便于密封。缓冲液内含电解质，充于电极槽和毛细管中，通过电极、导线与电源连通，一同构成整个电流回路。
温度控制
熔融石英毛细管在CE中应用最广泛，熔融石英拉制得到的毛细管很脆，易折断，一般在外表面涂有聚酰亚胺保护层，使之变得富有弹性，不易折断。
内径越小，表面积/体积比越大，散热效果越好。内径小，样品负载小，检测、进样、清洗等操作困难。
一般使用的毛细管柱内径在25 ~100 μm之间，最常用的是50 μm和75 μm两种。
检测窗口部位的外涂层剥离。
焦耳热效应产生径向温度梯度，还会导致分离重现性差。商品仪器大多有温度控制系统，主要采用风冷和液冷两种方式。
一般采用物理吸附或化学键合两种方式形成毛细管内壁涂层，对石英毛细管进行改性或修饰，可有效控制电渗流、抑制吸附进而优化分离。
检测系统
常用检测器
紫外：适合于有紫外吸收化合物
荧光：灵敏度高，通常需要衍生化
激光诱导荧光：灵敏度非常高，通常需要衍生化
质谱：通用性好，能提供结构信息
安培：灵敏度高，只适合于电活性物质
电导：通用性好
主要分类
将CE的高效柱和HPLC的高选择性有机结合起来，开辟了高效的微分离技术新途径，它的分离过程包含了电泳和色谱两种机制，溶质根据他们在流动相和固定相的分配系数不同和自身的电泳淌度差异而分离。
填充色谱
基于填充柱的电色谱是各种电泳中最新出现的一种技术。它是利用电渗透驱动极性溶剂通过反相高效液相色谱毛细管柱，利用试样在两相的分配进行分离。
胶束色谱
是在缓冲溶液中加入浓度高于胶束临界浓度的表面活性剂。胶束相在分离中起到了准固定相的作用，电中性的有机化合物按照它们在水相和有机相之间分配系数的差异进行分离。该方法也可用来改善带电有机化合物的分离选择性。
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