半连续发酵

发酵方法

半连续发酵(semi-continuous fermentation)，又称半连续培养、反复分批培养或换液培养，是指在分批培养的基础上，周期性地放出部分含有产物的发酵液，然后再补加相同体积的新鲜培养基的发酵方法。在实施半连续发酵的操作过程中，补充了新营养成分的反应体系的培养条件与分批培养条件相同，且反应器内培养液的总体积基本保持不变。半连续培养技术已在工业生产领域逐步得到应用。

简介

特点

微生物发酵可分为分批、补料分批、半连续、连续等多种模式。分批发酵的人力、物力消耗较大，每批发酵都需要进行装料、灭菌、接种、放料、清洗等操作，工序繁琐，发酵周期较长，生产效率较低；补料分批发酵虽可通过补料补充养分或前体的不足，但是由于有害代谢产物的不断积累，产物合成最终难免受到阻遏；连续发酵较分批发酵和补料分批发酵生产强度大大提高，但容易遭受杂菌的污染，菌种易退化，设备投资较大，且发酵产物浓度较低；半连续发酵过程中，通过放掉部分发酵液再补入新鲜培养基，不仅可以补充养分和前体，而且代谢有害物被稀释，从而有利于产物的继续合成。半连续发酵工艺的应用可以起到缓解产物抑制和避免代谢副产物积累的作用，改善了微生物的培养环境，有助于保持菌体活力的稳定，这也使其在某些初级代谢产物的生产过程中得到了应用，如醋酸、乙醇和乳酸等。对于某些次级代谢产物如青霉素、赤霉素、环孢菌素和洛伐他汀等，其最高的生产速率仅在某些瞬态条件下才能达到。采用半连续发酵工艺不仅可以使这种瞬态条件反复出现，而且还可以提高设备的利用率，因此半连续发酵工艺在次级代谢产物的生产方面有着重要的应用。除适合于动物消化道内微生物的体外培养外，半连续培养模式还能满足一些特殊微生物的培养要求。

分类

1、单级半连续发酵

单级半连续发酵具有操作简单和应用普遍的特点，但是它无法充分利用底物和菌体。在醋酸的单级半连续发酵过程中，有学者采用计算机模拟的方法，对不同的补料放料策略进行比较，研究结果表明对于高浓度醋酸的生产，在产物浓度达到指定值时补料放料更合适；其他情况下，在指定的时间下补料放料更合适。

2、多级半连续发酵

鉴于单级半连续发酵往往无法充分利用底物和菌体，许多学者尝试构建多级反应系统来提高底物的利用率和避免代谢产物或代谢副产物在后期影响菌体的活性。为了避免发酵后期菌体大量死亡并尽可能缩短发酵周期，有学者采用两级半连续发酵工艺进行琥珀酸的生产，生产强度达到2.38g/(L·h)，远远高于分批发酵和补料分批发酵的生产强度，取得了较好的效果。在两级半连续发酵生产二羟基丙酮的过程中，有学者采用荧光原位杂交技术，研究了高浓度产物对菌体生长的抑制作用，并据此确定了两级半连续发酵工艺中一级罐的补料放料时机（二羟基丙酮质量浓度达到82g/L），建立了一种比较稳定高效的二羟基丙酮生产方法。

应用

半连续发酵技术在工业生产和科学研究中已经得到了比较广泛的应用，主要涉及菌体的生产、微生物代谢产物的生产、垃圾的厌氧消化和动物消化道内微生物的体外培养。

1、菌体的生产

对于部分微藻的培养，无论是在规模化生产中还是在实验室研究中，半连续培养模式都是常用的模式之一。在微藻的半连续培养过程中，培养液的更新率对菌体生长和细胞内生化组分都有重要影响，是一个比较关键的参数。

2、微生物代谢产物的生产

应用半连续培养工艺规模化生产微生物代谢产物的实例主要有：醋酸、青霉素和酒精。

（1）醋酸

采用深层液体发酵工艺生产醋酸，醋酸的生成速率主要取决于醋酸菌的生长速率和活菌体浓度。在连续培养体系中，由于醋酸菌的比生长速率较低以及环境中高浓度醋酸的存在，导致了比产物生成速率较低，因此高产酸率和高浓度的醋酸发酵不宜采用连续发酵工艺。在醋酸的规模化生产中，目前广泛采用的是半连续发酵工艺。醋酸生产的基本工艺流程如下：当发酵进行至乙醇质量浓度接近于0时，放出40%的发酵液，然后加入等体积的新鲜酒醪进行再发酵，并保持整个发酵过程中通气和温度的恒定，醋酸的质量浓度可以达到13.3g/100mL。如果新鲜酒醪的添加方式正确和放罐时机掌握恰当，能够有效缩短下个周期发酵的延滞期，直接进入对数生长期。有关多级半连续发酵、发酵过程的控制和耐高浓度醋酸菌种的应用等相关研究也有报道，其主要目的在于进一步提高发酵液中的产物浓度。

（2）青霉素

青霉素被发现后的数10年间，该产品的生产技术得到了迅猛发展。最初的青霉素半连续发酵生产纯粹是依据经验进行控制的，但对于这样一个时变性和非线性的复杂发酵过程，仅仅依靠经验进行控制不能满足现代化生产的要求，为此许多学者致力于实现青霉素半连续发酵过程的模型化及在此基础上实行的优化控制研究。发酵动力学研究表明，比生长速率为0.015h-1时青霉素生产菌的生产能力最强。该研究结果应用于工业生产中，就形成了目前青霉素发酵工业中普遍采用的半连续流加发酵工艺，我国工业界通俗地称其为青霉素发酵带放工艺。青霉素半连续发酵工艺的大致操作为：达到发酵终点时，放出20%-40%的发酵液进入后续的提取工艺，同时补充相同体积的新鲜培养基继续进行发酵，这种操作可以反复进行多次而不会导致产量减少，还能增加发酵罐的体积利用率。另一种半连续发酵生产青霉素的方法，即将青霉素半连续发酵过程中带放的发酵液，通过管道转移到另一个无菌发酵罐中进行补料再培养，直至青霉菌进入自溶阶段。该方法充分利用了处于稳定期青霉菌的次级代谢能力，明显缩短了生产周期，有效降低了生产成本。

（3）酒精

酒精的规模化生产目前主要采用连续浓醪发酵工艺，尤其是年产几十万吨的大型生产企业。一般在4-6级连续发酵工艺中，通过减少整体返混的方式来缓解产物抑制。有关采用半连续发酵工艺生产酒精的研究也有报道，如在特大型发酵罐生产酒精的过程中，从设备投资和杂菌污染控制等方面对连续发酵工艺与半连续发酵工艺进行了比较，得出了在特大型发酵罐中采用半连续发酵工艺生产酒精更为合理的结论。半连续发酵生产酒精，一方面相对于分批发酵而言提高了设备利用率，缩短了发酵周期；另一方面为将来的连续发酵生产酒精打下了基础，以便整个酒精生产流程实现自动化控制。国外企业在生产酒精的过程中，通过将多级连续发酵工艺、同步糖化发酵工艺以及酵母的自絮凝技术相结合，显著降低了成本，优于国内企业多采用的半连续发酵工艺。除醋酸、青霉素和酒精之外，尚有许多微生物代谢产物已在实验室规模上实现了半连续发酵生产，其生产效率远高于现有的分批发酵或补料分批发酵模式，如乳酸、富马酸、甘油、脂肪酶、二羟丙酮等。对于这些代谢产物，实际生产过程中是否采用半连续发酵工艺应结合具体情况综合考虑。相对于分批发酵工艺而言，采用半连续发酵工艺可进一步提高发酵产率。因此，在原材料成本相对较高的情况下，应采用半连续发酵工艺使产率最大化；在设备及能耗成本相对较高的情况下，应采用连续发酵工艺使生产强度最大化。

3、垃圾的厌氧消化

垃圾的厌氧消化是指在厌氧微生物的作用下，垃圾中的有机物发生降解并趋于稳定的过程，该过程由水解产酸阶段和厌氧发酵产气阶段组成。目前，垃圾的厌氧生物处理方式较多，其中也包括半连续操作模式，有学者在实验室规模和实际生产规模中，对分批操作模式和半连续操作模式下甲烷的生产强度和挥发性固体的转移量进行了比较。由于半连续操作模式下污泥的稳定性更高，因此其生产效率相对高于分批操作模式。

4、动物消化道内微生物的体外培养

早在20世纪50年代，国外就开展了利用体外系统模拟胃肠生态系统的相关研究。1963年，Rufener等提出连续培养系统可以用于模拟瘤胃微生物系统；20世纪80年代以来，有报道认为采用半连续培养系统模拟肠道微生物系统能够取得更好的效果。在研究肠道菌群对异型生物质毒性的解除作用过程中，连续培养与半连续培养的区别主要在于营养物添加和废物移除的方式不同，连续培养系统虽然能够提供相对恒定水平的营养物，使微生物保持在稳定的状态，但回肠内的流质却是以类似脉冲的方式进入大肠，半连续培养模式与之更为相似，因此更适合于肠道微生物生态系统的模拟。

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