FISH技术

遗传学实验技术

荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是一种重要的非放射性原位杂交技术，出现于20世纪70年代末的遗传学实验技术。它根据碱基互补配对原则，通过特殊手段使带有荧光物质的探针与目标DNA接合，最后用荧光显微镜即可直接观察目标DNA所在的位置。

技术原理

荧光原位杂交技术的基本原理是如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性—退火—复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

技术要点

1.FISH选用的标本可以是分裂期细胞染色体，也可以是间期细胞。

2.生物素、地高辛、Dinitrophenyl （DNP）、Ami-noacetyl Fluorine（AAF）等均可用于探针标记。近年来，大片段的DNA探针（100-400 kb）已被研制出来，由于探针较长，故可将荧光物质直接标记在核苷酸上，使杂交过程进一步简化，而且杂交信号更强。

3.荧光原位杂交可以通过CCD（电荷耦合器件）相机系统或激光共聚焦扫描成像系统将摄取的信号存储在计算机中，经过软件特殊处理后显示在屏幕上。使用数码成像相机系统或CCD相机系统，灰度图像被拍摄几次并存储在计算机中，接下来通过一些人造色，软件系统接收获得的示例图像，经过软件的综合处理，最后以多色图像显示出来。此外，在G-带状染色体被75酒精或甲醇褪色后，FISH可以更清楚地识别易位。

实验流程

1.样品采集

2.固定

3.制备载片

4.细菌预处理

5.第一次杂交

6.第一次洗脱

7.封片

8.检测结果：可使用荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜等进行观察，结合相关软件，进行数据整理及分析。

技术发展

荧光原位杂交技术起源于1969年，自1990年以来，FISH在方法上形成了从一种颜色到多种颜色、从中期染色体FISH到粗线染色体FISH再到纤维-FISH的发展趋势，灵敏度及分辨率有了大幅度提高。

多色荧光原位杂交

多色荧光原位杂交（M-FISH）， “M”分别代表“Multi-color” “Multiplex”和“Multitar get”3种类型。M-FISH的最大特点是可以在单个 FISH 实验中进行多个繁琐的FISH实验和多个不同基因的定位。以下5种方法是基于多色彩FISH基础上开发的新技术：染色体描绘、比较基因组杂交、光谱染色体自动核型分析、交叉核素色带分析及多彩色原位启动标记。

DNA 纤维荧光原位杂交技术

Wiegant等首先利用化学方法染色体进行线性化，再以此线性化的染色体DNA作为载体进行FISH，使FISH的分辨率显著提高，就是最初的纤维-FISH。据一些文献记载，逐渐改进了DNA纤维舒展延伸的方法，使DNA纤维的伸展程度有了很大的变化。DNA纤维荧光原位杂交的关键在于如何制备具有高分辨率且高质量的线性DNA纤维，能进行定量分析。

组织微阵排列技术

微阵列可以在一个实验中检测一个细胞中数百个基因的表达（减少和增加。组织微阵列由组织微阵列区域中的500-1000个单个肿瘤组织与管状活组织检查组成。细胞的组织和cDNA微阵列技术的组合可以提供一种有力的体内鉴定基因的方法，可以对一些疾病及瘤的分子变化进行重要评估。

荧光免疫核型分析和间期细胞遗传学

荧光免疫核型分析和间期细胞遗传学是一种将荧光免疫核型分析和原位杂交相结合的方法，可以同时显示异种细胞群中单个肿瘤细胞的免疫表型和一定的基因变化。FICTION具有诊断快速且可以再现的优点，适用于FISH分析前或后没有所需以前细胞样品的细胞学样本。FICTION可用于分析血液肿瘤的系谱，更好地了解肿瘤病理组织。

技术应用

荧光原位杂交技术已经被应用于多个领域。

染色体研究

荧光原位杂交技术能够检测染色体结构变异，可以较容易地检测出缺失、附加或替换的染色体。将染色体或者部分具有特异性的染色体处理制作成为荧光探针，对细胞中期的染色体进行检测．可以发现染色体会呈现不同颜色的条带，进而可以确定基因在染色体上的准确位置，达到染色体描绘的目的．能够用于识别染色体重组、断裂点分布、鉴别染色体外核物质的起源等方面。

基因定位

基因定位是荧光原位杂交的最基础最成功的应用。利用荧光原位杂交灵敏、准确，并且可以一次检测多段基因等特点，可以确定目标基因的准确位置，确定几个基因之间的位置关系，以及基因与染色体端粒之间的关系，基因与着丝点的关系，是构建基因图谱的基本要素。荧光原位杂交技术被广泛地应用于基因的物理定位及基因图谱的绘制。

肿瘤诊断

肿瘤已经成为现代人类死亡的主要原因之一，肿瘤的提前确诊对治疗有着极大的帮助。过去诊断细胞样本中是否含有肿瘤细胞主要用巴氏染色法等一些细胞化学染色法，一些辅助诊断手段出现相比过去的方法更快捷简单，荧光原位杂交技术就是其中之一。荧光原位杂交技术已经被应用到膀胱癌、胆道恶性肿瘤、Barrett食管及食管腺癌、宫颈癌等多种肿瘤的初期诊断中，并且效果显著。

其余应用

另外，荧光原位杂交技术与其他技术的联用，如与免疫、量子点、微流控芯等技术联用，提高了效率，缩短了周期。

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