GMOs

自首例转基因番茄‘FLAVR SAVR’于1994年在美国批准商业化以来, 全球转基因作物种植面积持续增长, 据ISAAA公布的数据, 截止2012年底全球转基因作物种植总面积已达到1.7亿公顷, 较1996年增长了94倍多。种植面积排名前十的国家都超过了百万公顷, 其中美国为69.5百万公顷, 占40.8%; 其次是巴西, 占21.5%; 阿根廷占14.03%; 加拿大占6.8%; 印度占6.3%; 我国为400万公顷, 占2.4%, 位居第六。2012年共计59个国家和地区生产和应用转基因作物, 涉及25种作物、319个转基因事件。预计在未来的若干年里, 转基因的种植面积和商业化进程会持续增长, 并会对社会可持续发展产生深远影响。

从分子生物学水平来看, 转基因检测是针对其转入的外源基因后的特异性DNA序列和其表达的蛋白质展开的。因此, 转基因检测方法可以分为基于蛋白质水平的检测方法和基于核酸水平的检测方法两大类。

蛋白质检测技术都是基于免疫学的原理, 即转基因生物表达的特定蛋白可作为抗原和抗体特异性结合，是一种直观、快速的检测方法。酶联免疫吸附法和侧向流动免疫测定是两种最主要的基于蛋白的转基因产品检测方法。酶联免疫吸附法是一种将免疫反应和酶的高效催化反应结合的检测方法。外源目的蛋白与抗体结合后, 再结合酶标抗体, 加入底物后通过酶促反应形成有色物质, 就可根据颜色变化判断是否为转基因外源蛋白，并计算其含量。近年来, 研究者已经建立了不同转基因生物的ELISA检测方法, Kim等(2010)建立了一种ELISA方法检测韩国转基因辣椒Subicho不同组织中bar基因编码的乙酰转移酶和npt II基因编码的新霉素磷酸转移酶；Tan等(2013)发明了一种三明治式ELISA方法(sandwich ELISA), 可以检测转基因棉花中的胰蛋白酶抑制因子CpTI。此外, 全球各大公司也开发了各种商业化的ELISA转基因生物检测试剂盒检测不同外源基因表达的蛋白，其检测极限最高可达0.1%。侧向流动型免疫试纸同样基于抗原抗体特异性结合的原理, 以硝化纤维为固相载体, 在抗体上联结显色剂并固定在试纸条内, 将试纸条一端放入含有外源蛋白的组织提取液中, 通过毛细管作用使提取液向上流动, 抗体与外源蛋白结合则会呈现颜色反应, 一般5~10 min可以获得检测结果。Liu等(2013)发明了一种胶体金免疫试纸条, 可成功检测转基因牛牛乳中的人乳铁蛋白。很多转基因检测侧向流动型免疫测定试纸条已经商业化应用。

由于核酸分子, 特别是DNA分子的稳定性强, 基于核酸的检测方法已成为转基因生物检测的主要手段(张建中等2011), 主要的核酸检测技术包括定性PCR和实时荧光定量PCR。近年来, 已有大量文章报道了不同转基因生物品种的定性PCR和定量PCR检测方法(表4)。但无论使用定性还是定量PCR技术, 转基因产品检测都基本按照以下流程进行。(1)检测是否含转基因成分: 通过筛选PCR确定样品中是否含转基因作物的通用元件、标记基因等; (2)具体含有什么转基因作物品系: 通过构建特异性和品系特异性检测方法来鉴定转基因成分具体源于哪种特定的转基因品系; (3)转基因成分含量: 运用定量PCR的方法来测定样品中转基因成分的具体含量。

随着转基因数量急剧增加, 开发多靶标、高通量的PCR检测方法日益重要, 各种新型复合PCR方法应运而生, 包括复合PCR、兼并复合PCR和微滴复合PCR等。复合PCR是指在一个反应体系中, 同时加入多对引物, 扩增不同的特异性片段, 最后通过凝胶电泳分离这些片段。Lu等(2010)成功建立了能同时检测6种常见转基因元件多重PCR, 分别针对35S启动子、NOS启动子和终止子、nptII (neomycin phosphotransferase, 新霉素磷酸转移酶基因)、CP4epsps (5-enol form pyruvic acid-shikimic acid-3-phosphate synthase, 5-烯醇式丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合酶)基因和pat (phosphinothricin Nacetyltransferase, 草丁膦转移酶)基因。兼并复合PCR (degenerate MPCR)是通过设计兼并PCR引物来检测一种针对同一性状基因或一类性状基因的同源核苷酸序列的新型复合PCR。Guo等(2012)建立了一种四重兼并引物PCR方法, 同时扩增转基因作物主要使用的8个外源目的基因, 理论上可覆盖90余种转基因作物。微滴PCR(microdroplet PCR)技术可将单个DNA分子被分配到纳升级(0.5 fL~0.5 nL)的微滴中进行扩增, 1uL乳化剂中能形成约107个反应, 可极大提高扩增通量, 减低复合PCR中多对引物和多模板间的干扰。Guo等(2011)发明了一种微滴聚合酶链式反应-毛细管凝胶电泳分析系统(MPIC), 同时检测了9个转基因品种的24个靶标, 检测灵敏度可达39个拷贝。DNA芯片技术日趋成熟, 使用DNA芯片进行转基因生物的高通量检测已得到商业化应用。如Nesvold等(2005)设计了一种基因芯片用于检测单个未知转基因生物。新发展的Tilling芯片含有高密度的覆瓦式的寡核苷酸探针, 能够高密度、高通量地从全基因组水平上对转基因生物进行分析,已经用于未知或者非法转基因生物的检测。二代测序技术(next-generation sequencing, NGS)即高通量测序, 一次实验可以读取1 G到14 G碱基数。现有的技术平台主要有454焦磷酸测序、Solexa测序、SOLiD测序、Polonator测序和HeliScope测序技术等(Mardis 2008)。二代测序技术是在传统测序技术上飞跃性的进步, 在转基因检测中将具有广阔的应用前景, 如Teng等(2009)通过454焦磷酸测序, 并基于计算机减法算法建立了一种未知转基因拟南芥的检测方法, 为未知转基因生物的检测提供了一种可能。等温扩增技术是近年发展起来的快速核酸检测技术, 扩增过程不需要温度循环, 较PCR技术有快速、低成本、灵敏等优点。核酸等温扩增技术有很多种, 其中环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)已较多的应用在转基因检测中。LAMP技术通过设计能识别靶标序列6个区域的2对引物, 在Bst聚合酶作用下, 经过恒温(60~65 ℃)约40 min即可完成核酸扩增(Notomi等2000)。Lee等(2009)通过LAMP方法检测到了转基因油菜和大豆中的35S启动子和NOS终止子, 灵敏度可达0.01%转基因含量; Chen等(2011)则发明了一种可视化的LAMP技术, 可通过肉眼直接判断样品中是否含有转基因产品; Kiddle等(2012)则通过将一种荧光报告基团BART与LAMP技术联用, 可以检测到0.1%转基因含量, 提高了LAMP检测的灵敏度。数字PCR (digital PCR)是近几年新发展起的一种核酸精确定量技术, 该技术是通过将微量样品大倍数稀释和细分, 直至每个细分试样中所含有的待测分子数不超过1个后, 再将所有细分试样同时在相同条件下进行PCR扩增, 之后对细分试样逐个进行计数, 从而判断样品的起始数量。数字PCR是一种绝对测量方法, 无需建立标准曲线, 并且检测的灵敏度高达1.85拷贝·微升-1(Leonardo等2011)。数字PCR主要有三类平台, 分别是基于集成流体通路(IFC)芯片技术的数字PCR (chamber 数字PCR)、微滴式数字PCR和基于亲疏水芯片和通道技术的数字PCR。数字PCR已经应用于转基因生物检测, 特别是转基因标准物质的量值测定。如Corbisier等(2010)使用数字PCR技术对转基因玉米MON810制备的欧盟标准物质的内、外源基因进行了绝对定量分析, 其结果和欧盟的定值结果一致; Burns等(2010)分析了数字PCR在转基因检测中的应用, 认为该技术非常适用于极低拷贝转基因样品定量和标准物质的定值。