NASBA

依赖核酸序列的扩增技术

所谓NASBA（Nuclear acid sequence-based amplification，核酸依赖性扩增检测技术）是一项以RNA模板进行等温核酸扩增并能实时观测结果的检测方法。

该技术的检测反应有赖于AMV逆转录酶、噬菌体T7 RNA多聚酶、核糖核酸酶H、两种特别设计的特异性寡核苷酸引物和分子信标探针共同协作而完成。

NASBA全称是nucleic acid sequence-based amplification，即依赖核酸序列的扩增技术。依赖核酸序列的扩增技术，是一种扩增RNA的新技术，是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。反应在42℃进行,可以在2h左右将模板RNA扩增约10^9～12倍，不需特殊的仪器。NASBA已经广泛应用于细菌、病毒等多种病原微生物的检测。

该技术是由一对特异的引物介导的、三种酶催化的以单链RNA 为模板的恒温扩增技术，具有操作简单、特异性强、灵敏度高、不易被污染等优点，已广泛应用于病毒、细菌、霉菌、寄生虫和细胞因子等的检测，特别是用于艾滋病病毒、丙肝肝炎病毒等RNA 病毒的检测当中。在动物疫病预防控制方面， NASBA 方法已成为诊断禽流感病毒的国家诊断标准方法之一（GB/T19440-2004 禽流感病毒NASBA 检测方法）。同时，在植物病害防疫检查等方面也有重要用途。

尽管RNA的扩增也可以使用反转录PCR技术（通过反转录形成单链DNA模板），但与NASBA相比，NASBA则有自己的优势：可以在相对恒温的条件下进行（一般恒温为41摄氏度）。该技术主要用于医学诊断，相对传统的PCR技术更为稳定、准确。

NASBA的简要过程如下：1.RNA模板链进入反应混合物后，第一个引物首先与模板链的3'端结合。2. 反转录酶，合成反义的补偿的DNA链。3. RNA 酶H（一种核糖核酸内切酶，能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链，但不能消化单链或双链DNA），分解破坏RNA模板链。4.第二个引物与DNA的5’端结合。5.T7 RNA polymerase 合成RNA补偿链，并加入到步骤1中，使反应可以循环进行。NASBA技术已经被用于多个单链RNA基因组的病原性病毒的快速检测试验中。

标准的NASBA 反应体系中含有T7RNA聚合酶（一种RNA聚合酶，分子量约99kDa，专门催化5'→3'方向的RNA形成过程）、RNA se H（一种逆转录酶，可以消化mRNA）、禽骨髓白血病病毒（AMV）逆转录酶、核糖核苷三磷酸（NTP）、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、一对特殊引物及根据需要使用的各种反应缓冲液等。引物P1 长约45个碱基，其3’末端大约20 个碱基对与模板的3’末端互补，5’末端含有能被T7 噬菌体RNA 聚合酶识别的启动子序列；引物P2 大约20个碱基长，其序列与模板的5’末端一致。AMV 的作用是以单链RNA 为模板合成互补的cDNA 及以cDNA 为模板合成双链DNA。RNAseH 在体系中的作用是将RNA-cDNA 杂合分子中的RNA 降解，T7 噬菌体RNA 聚合酶则是识别双链DNA 中的启动子区，催化DNA 转录为RNA。

1 核酸提取

NASBA 方法的核酸提取可按照常规的RNA提取方法进行，根据实际需要可以采取不同的方法。

2 核酸扩增

将纯化的RNA 加到标准的NASBA 反应体系中后，先在65 ℃条件下作用5 min 去除RNA 的二级结构，然后在恒温的42 ℃条件下开始扩增反应。

3 产物的检测

直接检测是早期应用的比较简单的检测方法，应用的较少。具体操作是将反应产物直接在琼脂糖甲醛变性凝胶上电泳，用EB（溴化乙锭）染色，在紫外灯下观察单链RNA 片段的长度。该方法只能初步检测反应产物，如果进一步鉴定反应产物还需要结合其他检测方法，如Northern blot、限制性酶内切位点分析等。

寡核苷酸检测该方法，是将NASBA 技术和ELISA (酶联免疫吸附剂测定)方法相结合，其原理与电化学发光检测类似，都是通过将与检测信号有关的物质标记在核酸探针上，通过检测该信号从而间接检测RNA。不同的是核酸探针上是用地高辛（Digoxygenin，DIG）标记的，通过探针捕获将地高辛标记的探针和NASBA 产物的复合物吸附到微量反应板上，作用于底物硝基苯基磷酸盐显色，然后通过分析吸光度来检测RNA 产物。该方法需要使用酶标仪。

国内外的研究结果均表明，草莓组织中富含多糖等物质，分离优质核酸较困难，核酸中的杂质影响taq DNA聚合酶的活性，从而影响PCR技术在草莓病毒检测中的应用。为了提高利用PCR技术草莓病毒检测的稳定性，国内外的学者在草莓核酸提取方法做了较多的研究，利用OIAGEN公司生产的植物RNA提取试剂盒(Plant RNeasv Kit)能够快速地(约1h)从草莓叶片中提取出较高质量的总RNA。但是这种试剂盒很贵，不适合用于大规模精细的研究应用。

NASBA中主要是反转录反应和T7 RNA聚合酶合成RNA的反应。一般认为核酸中的多酚、多糖杂质对反转录酶的影响相对较小。对T7 RNA聚合酶受影响可能也较小．而且即使在有DNA污染或存在的情况下．同样具有较高的特异性和灵敏度。NASBA还具有高灵敏度的优点，与嵌套PCR(Nested PcR)灵敏度相近。因此，利用NASBA检测草莓植株中的病毒比利用PCR检测草莓植株中的病毒更为有利。在不涉及病毒含量的定性检测研究中。可以采用琼脂糖凝胶电泳来检测NASBA产物。

NASBA技术不需要PCR仪，在一般实验室内即可完成，而灵敏度高于PCR，对DNA病毒、RNA病毒和类病毒都可以检测，在检测RNA病毒时不受模板中DNA的干扰。为了提高精度，还可以使用分子信标，一般将NASBA技术和分子信标结合称之为AmpliDet RNA。NASBA在检测果树病毒中最早应用于CTV的研究中，以叶片、树皮为试材皆可以稳定地进行检测。Vaskova等利用NASBA结合分子信标对SVBV进行了检测，灵敏度可达到lng(纳克)左右。此外，NASBA技术还被用于检测南芥菜花叶病毒、悬沟子环斑病毒、番茄黑环病毒和番茄环斑病毒、柑橘裂皮类病毒、柑橘类病毒IV的研究中。利用NASBA技术也可以同时检测多种病毒，如Klerks等同时检测马铃薯卷叶病毒和马铃薯病毒Y，Szemes等同时检测PVY的3个株系。

相对于免疫学方法或其他基因检测法，NASBA在试验的快速、敏感性、特异性方面有更多的优势。

特异性强：NASBA是一种快速、等温的RNA扩增技术，通过AMV逆转录酶和T7 RNA聚合酶进行的扩增反应，因为反应条件温和以及比PCR短的反应时间，因此转录更加忠实于模板，错配率很低，因而特异性更强。

检测快速：由于反转录过程被直接合并到扩增反应中，因此NASBA最适合分析RNA样品。在标准条件下，这项测试能在4小时左右结束。

敏感性高：NASBA反应产物是单链RNA，因而可采用杂交检测系统来提高该技术的敏感性和特异性。其敏感性已与传统的鸡胚接种法相当。

适用于检测样品的范围广：由于NASBA技术的反转录过程被直接合并到扩增反应中，因此NASBA最适合分析RNA样品。样品中DNA、肝素、柠檬酸盐、血红蛋白、白蛋白和脂质等的污染将不会对结果造成影响，因而适用于可能不适合其他试验检测的样品。

NASBA技术的检测成本较高，大多处于研究阶段，但国外的一些研究计划已将其列为重点发展的检测手段，并制备检测试剂盒。

果树组织中病毒含量一般较低，难以检测，这对病毒检测方法有较高的要求。与传统的果树病毒检测方法相比，病毒核酸检测方法具有检测速度快、灵敏度高、特异性强等优势，因而成为果树病毒检测发展的方向，特别是以PCR技术为基础的检测方法发展迅速。由于NASBA技术进一步提高了检测效率和检测速度，因此发展前景较好，特别是利用荧光实时PCR和NASBA同时检测多种病毒是发展的主要方向。

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