非损伤微测技术

基因功能研究中的活体检测技术

源于美国伍兹霍尔海洋生物学实验室，由神经学家Lionel F. Jaffe于1974年发明。NMT是基因功能研究中的一种活体检测技术，可在不损伤样品的前提下检测分子/离子进出生物活体的流速（流动速率和方向），基于NMT商业化的设备统称为非损伤微测系统。

诞生

非损伤微测技术诞生于美国著名的伍兹霍尔海洋生物学实验室（MBL, Woods Hole Marine Biological Laboratory）。

自1974年神经科学家Lionel F. Jaffe提出原初概念，到1990年成功应用于测定细胞的Ca流速，已经解决了众多科学问题。今天，非损伤微测技术在生命科学、环境科学、材料科学等领域广泛应用，在国际顶尖杂志《Science》、《Nature》、《PNAS》、《Plant Cell》、《Environmental Science & Technology》等发表了大量科研成果。非损伤微测技术的活体、动态和实时的测量方式，以及高分辨率和高灵敏度，将加深人类在科研领域的工作，促进对自然界的认识。

NMT（Non-invasive Micro-test Technology）是非损伤微测技术的简称。源于美国伍兹霍尔海洋生物学实验室，由神经学家Lionel F. Jaffe于1974年发明。NMT是基因功能研究中的一种活体检测技术，可在不损伤样品的前提下检测分子/离子进出生物活体的流速（流动速率和方向），基于NMT商业化的设备统称为非损伤微测系统。

原理

以测量Na的流速测定为例，说明其基本的工作原理。Na选择性微电极通过前端灌充的液态离子交换剂（Liquid Ion eXchanger，LIX）实现Na的选择性。该微电极在待测离子浓度梯度中以已知距离dx进行两点测量,分别获得电压V1和V2。两点间的浓度差dc则可以从V1、V2及已知的该微电极的电压/浓度校正曲线(基于Nernst方程)计算获得。D是离子的扩散常数( 单位：cm·sec)，将它们代入Fick第一扩散定律公式J = -D· dc/dx，可获得该离子的流动速率(pico mol·cm·s) ，即：每秒钟通过每平方厘米的该离子/分子的摩尔数（10级）。

注：荧光染料/光纤、纳米碳丝、酶电极、金属/合金等均可用来实现对某种离子/分子的选择性测量。

可测离子分子

Ca2+、H+、K+、Na+、NH4+、Mg2+、Cd2+、Cl-、NO3-、Pb2+、Cu2+、Ag+、Ar+、Cs+、Tl+、Zn2+、Al3+、HPO42-、O2、IAA、H2O2、葡萄糖、抗坏血酸、谷氨酸、水杨酸、尿素等

技术特色

活体、原位、非损伤测量

对整体或分离后的样品不造成损伤，获取正常生理状态下的信息。

实时、动态测量

动态实时地（5秒左右）测量和获取数据。

两种离子和分子同时测量

能够同时测量某两种离子，或者同时测量一种离子和一种分子。

长时间持续测量

可进行长达几个小时，甚至更长时间的实时和动态监测。

无需标记

预先知道测定的是何种离子或分子，无需用放射性、化学或药理学等标记方法进行标记。

多种测量方式

可进行流速和浓度的点、线、面及立体矢量扫描测量，且支持实时、手动、自动及编程等多种方式。

高分辨率

时间分辨率：5s

空间分辨率：1μm（正常测量尺度）

离子分子浓度测定精度： 10-9M

离子分子流速测定精度：10-15mol· cm-2 · s-1

无需提取样品

直接测量，不需要研磨等传统的提取方法。

适用于多种样品

整体、器官、组织、细胞、甚至富集细胞器都可以测量（原则上大于5μm即可）。

立体3D流速测量

可在样品外进行X、Y、Z三维数据采集，清晰阐明样品及流速的空间相互关系。

应用方向

动物医学

1.生理调控研究

2.糖尿病研究

3.神经研究

4.肿瘤药物抗药性研究

5.药理研究与药效评价

6.骨骼研究

7.（干）细胞凋亡活体检测与研究

植物学

1.植物抗盐等逆境研究

2.蛋白功能研究

3.植物发育调控

4.光合/呼吸作用研究

5.植物营养研究

6.植物与微生物相互作用

7.植物发育调节机制研究

8.重金属污染与治理研究

微生物学

细胞膜的研究

环境科学

生态环境监测与分析研究

技术的结合

与激光共聚焦技术结合的优势

经典应用：

葡萄牙学者Anne-Frédérique Antoine在《Nature Cell Biology》发表研究论文，应用非损伤微测技术和激光共聚焦技术同时检测卵细胞与配子融合过程中卵细胞内外Ca的变化情况。使用非损伤微测技术检测发现，在融合一瞬间，胞外Ca有一个非常明显的内流，而此时激光共聚焦技术发现胞内Ca显著增加。说明卵细胞和配子融合过程中胞外的Ca参与了这个重要的生命过程。

与膜片钳技术结合的优势

经典应用：

剑桥大学的Matthew Gilliham等研究人员在《The Plant Journal》发表研究论文，应用膜片钳技术获得小麦根原生质体的全细胞外形及电流-电压关系，并通过检测出质膜K和Ca净离子流速，与通过膜片钳技术测得的电流强度做比较后发现，K流速/强度的比值变化反映了质膜上KORC通道的不同分布，而且Ca流速与K通道的激活并没有相关性。

研究表明当检测到较强的Ca流时并未产生电流，也就是使用膜片钳技术研究Ca通道时，即使没有检测到电流，但很可能存在Ca流。所以，同时检测跨膜的离子流和电流才能准确地确定离子载体和离子通道的数量和类别。

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