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northern印迹杂交

将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法

Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。

简介
Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在上样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2'-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照相，样品胶则进行Northern转印。标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L醋酸铵中10min，光在水中就可脱色，在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或在白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。
琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。
原理：
整合到植物染色体上的外源基因如果能正常表达，则转化植株细胞内有其转录产物——特异mRNA的生成。将提取的植物总RNA或mRNA用变性凝胶电泳分离，则不同的RNA分子将按分子质量大小依次排布在凝胶上；将他们原位转移到固定膜上；在适宜的离子强度及温度条件下，用探针与膜杂交；然后通过探针的标记性质检测出杂交体。若经杂交，样品无杂交带出现，表明外源基因已经整合到植物细胞染色体上，但在该取材部位及生理状态下该基因并未有效表达。
RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法
试剂
10×MSE缓冲液：0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸钠，1mmol/LEDTApH8.0。
5×载样缓冲液：50%甘油，1mmol/LEDTA，0.4%溴酚蓝。
甲醛：用水配成37%浓度（12.3mol/L），应在通风柜中操作，pH高于4.0。
20×SSC；
去离子甲酰胺；
50mmol/LNaOH(含10 mmol/L NaCl)；
0.1mol/LTris，pH7.5。
步骤
[1]40ml水中加7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60℃，加7 ml 10×MSE缓冲液，11.5ml甲醛，加水定容至70ml，混匀后倒入盛胶槽。
[2]等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。
[3]使RNA变性（最多20μg），RNA4.5ml，10×MSE缓冲液20ml，甲醛3.5ml，去离子甲酰胺10ml。
[4]55℃加热15min，冰浴冷却。
[5]加2 ml 5×载样缓冲液。
[6]上样、同时加RNA标记物（同位素（32P）dCTP）。
[7]60伏电泳过夜。
[8]取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。
[9]室温下将胶浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCl中45min，水解高分子RNA，以增强转印。
[10]室温下将胶浸到0.1mmol/L TrisHCl(pH7.5)中45min，使胶中和。
[11]20×SSC洗胶1h。
[12]20×SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。
[13]取出硝酸纤维素膜，80℃真空烘烤2h。
注意事项
[1]严格遵守试验规则，务必准确。
[2]由于好多药品是有毒的，对人体有害，请注意自身安全，做好防护。
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