RNA原位杂交

杂交方法

RNA原位杂交是可提供RNA在组织细胞的空间表达信息的一种杂交方法，分为传统RNA原位杂交、新一代RNA原位杂交。

引言

原位杂交早在1969年开始使用，并于1981年开始用于RNA 的原位杂交检测[1, 2]。

但一直以来，由于缺乏敏感性和特异性，RNA原位杂交一直受到较大的限制。科学家们一直在致力于改进RNA原位杂交。

传统RNA 原位杂交

Isotopic ISH

使用放射性标记的RNA探针进行的。Isoptopic ISH 可以达到高敏感性，但是需要很长的曝光时间（数天到数周），同时只提供有限的形态学数据。该种杂交方法由于使用的探针很长，曝光时间也很长，所以存在非特异性杂交以及长时间曝光导致与高背景干扰信号产生。由于以上问题以及放射性污染，从而限制了此项技术的普遍应用。

非-ISOTOPIC ISH

荧光标记或者生物素寡核苷酸探针的应用极大程度地促进了RNA原位杂交的应用，该方法缩短了实验时间，同时达到了放射性探针的杂交敏感性。这类探针可以在杂交后通过荧光或者可见光酶促反应成像。作为一种DNA探针的替代物，RNA探针使用ribo探针，该探针可以通过体外转录产生，通常有几百个碱基。与DNA寡核苷酸探针相比，ribo探针可以和目标RNA形成更加稳定的杂交，从而允许使用高强度的洗脱条件来增加非特异性。但是，由于RNA的天然特性，使得该类探针的标记物位点有限，由于存在非特异性结合导致较高的非特异性杂交，导致DNA 寡核苷酸探针与RNA riboprobes 探针的信噪比无法有效控制。另外，在检测灵敏度上也有一定局限。对于低水平表达或者部分降解的RNA，不能做到很好的检测。

直接法RNA 原位杂交

直接检测RNA 原位杂交方法，例如市场上Biosearch 公司（Stellaris ™ , Biosearch TechnologiesPetaluma, CA）使用直接荧光标记的小的单链寡核苷酸探针。多个探针设计针对每个目标RNA，每个与一小段序列互补，它们结合延伸至整个序列的长度。以这种方式，使用多个探针可以确保提高灵敏度，并且在不可避免的一个或两个探针非特异性杂交背景下荧光信号足以观测到。由于直接检测标记的探针，这项技术是简单而快速的。然而，该技术的灵敏度和信噪比仍然很局限，需要专门的去背景算法进行结果分析。

新一代RNA原位杂交

RNAscope® 原位杂交

RNAscope®专利技术是近年来最火的RNA原位杂交技术，是RNA原位杂交（ISH）领域的一项重大进步。由Advanced Cell Diagnostics公司（Newark, CA）开发，通过专利的双“Z”探针设计和信号放大系统，使RNA原位杂交具有高度特异性、单分子检测的敏感性并有极高的信噪比，能够在单细胞水平同时定量多个RNA的表达，在获得单细胞中单拷贝RNA表达数据的同时提供完整的组织形态学信息[3]。

RNAscope 方法克服了以前的RNA原位杂交技术的非特异性杂交、灵敏度低、对样本要求高等弱点，可替代传统的ISH/FISH RNA 原位检测，同时单分子检测灵敏度提供了在组织细胞原位对单个细胞中基因的表达进行检测，释放RNA作为生物标记的全部潜能，提高对疾病与标志物之间复杂的生物学相关性的认识，是理想的能够用于NGS和芯片技术后期转化研究技术平台。

RNAscope® 原位杂交步骤

RNAscope®原位杂交是一项新颖的用于检测位于组织细胞原位的目标RNA的原位杂交（In Situ Hybridization，ISH）检测技术。该技术进行RNA原位杂交检测主要分成5步。

Step 1：透化：通过RNAscope®预处理试剂盒处理载玻片上固定好的组织或细胞，暴露目标RNA。

Step 2：探针杂交：针对靶基因设计RNAscope®专利Z型探针与目标RNA杂交。

Step 3：信号放大：RNAscope®检测试剂盒逐级信号放大。

Step 4：信号可视化：在普通光学显微镜或者多光谱荧光成像系统下，每一个目标RNA分子以一个点状信号的形式呈现。

Step 5：量化分析：显微镜下直接计数或者使用图像分析软件如RNAscope® SpotStudio™ 或HALO对每一个细胞中的RNA单分子信号进行精确定量分析。

新一代国产RNA原位杂交

PinpoRNA®原位杂交

PinpoRNA®专利技术是近年出现的国产唯一的新一代RNA原位杂交技术，该技术利用创新的短片段探针组合设计（成簇探针同时结合于设计位点方可产生信号，单一探针非特异结合无法产生有效信号，专利号：CN202110581853.9），结合特别的核酸蛋白级联信号放大系统（专利号：CN202110575231.5）,同时解决了特异性和灵敏度问题，可以在组织切片上检测1-10拷贝的目标RNA分子。只要目标RNA分子序列已知且长于100碱基，即可设计相应探针进行检测。整个实验大约需时6小时并只需使用常规原位杂交仪。

PinpoRNA ®原位杂交实验步骤

Step 1：样本前处理：通过烤片、脱蜡、煮沸、消化等一系列步骤对载玻片上固定好的组织或细胞进行样本预处理，以暴露目标RNA分子。

Step 2：探针杂交：针对靶基因设计pinpoRNA®专利的短片段探针组与目标RNA杂交。

Step 3：信号放大：逐级信号放大。

Step 4：信号可视化：在普通光学显微镜或者多光谱荧光成像系统下，每一个目标RNA分子以一个点状信号的形式呈现。

Step 5：量化分析：显微镜下直接计数或者使用图像分析软件对每一个细胞中的RNA单分子信号进行精确定量分析。

PinpoRNA ®原位杂交检测试剂盒由于具备超高性价比，打破国外技术垄断，在科研领域及新药研发领域推进国产试剂的进口替代，突破卡脖子技术限制。同时pinpoRNA®的各类具有临床应用的原位杂交试剂盒（如HPV 高危18亚型mRNA原位杂交检测试剂盒及白蛋白mRNA原位杂交检测试剂盒等）已经进入国内的病理辅助诊断领域，随着技术的不断进步和新的具有临床诊断意义的RNA靶点被陆续发现，其应用前景将非常广阔。

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