RT-PCR技术

生物学技术

RT—PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段。RT—PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发夹结构的真核细胞mRNA，3种都可。

操作步骤

1、从RNA（或mRNA）反转录合成cDNA第一链：

2、于95℃加热5～10min，灭活反转录酶，使RNA—cDNA杂交体变性，然后迅速冰浴冷却：

3、PCR扩增：方法基本同PCR。

cDNA第一链合成方法：20ul反应液中含10xPCR扩增缓冲液，2ul；四种dNTP（10 mmol/L）2ul；RNA酶抑制剂20U；mRNA，l～2ug（或RNA 5-10ug）；AMV，20U；引物，1u；最后用灭菌水补至20ul。以上溶液充分混匀后，于42℃反应60min，反应完毕后将反应管在95℃下加热5min，使反转录酶失活和RNA—cDNA杂合物变性。其后反应液则可置于-20℃下保存备用。

注意事项

1、合成cDNA的引物：合成cDNA引物时，通常采用随机六核苷酸引物能够有效地指导从RNA有效地合成第一链cDNA：

2、避免RNA酶的污染：在合成cDNA第一链时，应使用RNA酶抑制剂，进行RT-PCR时，用于合成cDNA第一链的RNA不会对PCR有影响，因此没有必要用碱或RNA酶处理；

3、不同来源的逆转录酶均可较好地用于第一链cDNA的合成，但不同来源的逆转录酶反应温度有所不同。如来自鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV）与来自鼠白血病毒莫勒尼株（Mo-MLV）均可用于合成第一链cDNA，AMV要求的反转录温度为42℃，而Mo-MLV则要求37℃，相对而言，Mo-MLV比较适合于RT-PCR，但由于其作用的最适温度为37℃，较AMV的42℃低，因此，对于具有较高二级结构的RNA模板可能会带来不利的影响。

影响因素

（一）组织或细胞样本

不是每种组织或细胞都表达所有的基因，即某些基因的mRNA不存在于某些组织或细胞中。因此，确定所选用的材料中是否含有需扩增的目标mRNA模板是实验成败的关键。

（二）引物

合成cDNA第一条链时，引物可用随机6聚核苷酸，或下游引物，或poly（dT），其中以6聚核苷酸的随机引物效果最好。

（三）反转录酶

不同来源的反转录酶均可较好地用于第一链cDNA的合成，其合成受不同RNA模板的影响。提高反转录温度（55℃）、增加1～3倍的酶量可克服RNA二级结构的影响。

（四）cDNA反应产物

合成eDNA第一链所用的RNA模板不影响PCR反应，无需用碱或RNase处理去除。另外，没有必要将cDNA反应产物全部用于PCR，用其1/25～1/10即可。

（五）RNA酶污染

避免RNA酶污染是RT—PCR成功的关键之一。用于RNA操作的各种器皿，包括Eppen—dorf管、Tip头等，都应该用RNA酶抑制剂处理，试剂应该用RNase—free水配制。使用的全部器皿和耐高压的试剂都必须经高压灭菌处理。在操作全过程中，操作者都应该戴一次性手套和口罩，以防污染。

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