半数组织培养感染剂量

利用动物体或组织细胞培养增殖病毒后形成的病毒培养物

利用动物体或组织细胞培养增殖病毒后形成的病毒培养物，有时需要测定其感染力，即毒力。通常测定的方法可采用组织培养的细胞进行测定，该种方法称为半数组织细胞感染剂量(50% tissuecultureinfectivedose，TCID50)。

简介

半数组织细胞感染剂量（TCID50）通常指病毒感染鸡胚、动物或细胞后，引起50%发生死亡或病变的最高病毒稀释度。TCID50的测定可以估计病毒感染性的强弱及病毒的含量，但不能准确测定感染性病毒颗粒的多少。

病毒TCID50测定

实验目的

掌握TCID50测定的原理、试验方法、分析结果和计算。

实验原理

TCID50及半数培养感染剂量(50% tissue culture infectivedose)，以使50%的试验培养细胞出现感染反应的病毒稀释液的稀释度倒数的对数值来表示。多数病毒感染体外培养的细胞后，常引起细胞形态学改变，如细胞团缩、裂解和细胞肿大等，这种改变称为病毒致病变效应(cytopathic effect，CPE)，可以直接通过显微镜观察，亦可通过染色识别和判断。CPE的程度可间接反映病毒的毒力，因此利用这种特征可以测定病毒的毒力。

它所测定的不是病毒颗粒的数目，而是病毒感染反应的有或无，严格说来是一种定性测定法。但是因为感染反应的有或无与病毒颗粒数目之间有一定定量关系，且该法灵敏度高，重复性好，所以仍广泛用于病毒的定量测定，特别是应用于某些病毒的试验诊断及病毒毒力和宿主抗性的定量分析。

在从事药物的抗病毒试验中，常用100TCID50的病毒感染量进行。测定时，首先在微量细胞板上培养敏感细胞，待细胞贴壁形成单层时，弃上清液。将待测病毒用维持液做连续10倍系列稀释后加入细胞单层，逐日观察，直至病毒产生的CPE不再进展为止。具体时间根据病毒的增殖特点而定，如肠道病毒增殖迅速，一般48h即可；RSV、VSV增殖也较快，因此48～72h也可以观察、染色、计算。

实验材料

(1)Hela细胞系。

(2)0.2%EDTA溶液(无钙、镁离子的PBS配制)，68.95kPa蒸汽灭菌(115℃)10min。

(3)1万单位/ml青霉素、链霉素。

(4)1640培养基、新生小牛血清。

(5)7.5%NaHCO3真空抽滤除菌。

(6)脊椎灰质炎病毒I型(疫苗株)。

(7)稀释液同细胞维持液。

(8)细胞生长液：1640+10%新生小牛血清。

(9)细胞维持液：1640+2%新生小牛血清。

(10)无菌青瓶及瓶塞、无菌10ml吸管及吸耳球、无菌100ml三角瓶(盛培养基用)、烧杯、无菌试管。

实验方法和步骤

1、单层细胞制备

Hela细胞于青瓶中37℃培养24h，待生成单层后备用。

2、病毒液稀释

病毒液作10倍稀释，先将稀释液分装于10个试管中，每管0.9ml，取0.1ml病毒悬液加入第一管中，摇匀后为10-1，换一支吸管，在10-1病毒液中吸放3～4次，取0.1ml放入第二管中摇匀后为10-2........，如此稀释至10-10。

3、病毒接种

将40个已长好细胞单层的青瓶中的培养液倒掉，取上面已稀释好的病毒液接种于细胞单层，每瓶0.1ml，10-3～10-10每个稀释度分别接种4瓶，另取病毒原液接种4瓶细胞，每瓶0.1ml，作为病毒对照。再取4瓶细胞分别接种0.1ml培养基作为正常细胞对照。接种完毕后一起放入37℃温箱内，吸附1～1.5h。

4、结果观察

吸附完毕后倒掉病毒液或稀释液，每瓶细胞中各加入1 mI细胞维持液。置37℃培养，24h后观察结果，并按下表记录结果。观察时先看正常细胞对照，然后看试验瓶细胞。

5、实验结果的分析与计算

(1)实验结果。

(2)计算

根据Reed—Muench公式

半数效应剂量(LD50，ID50或TCID50等)=50%感染的高临界稀释度倒数的对数+距离比×稀释系数的对数

式中：距离比=（50%的临界感染率-50%）/（50%的临界感染率-50%的低临界感染率）

在上例中：

TCID50=lg(1/10-5)+（80-50）/（80-20）xlg10=5.5

该病毒样品的TCID50效价为10-5.5。

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