yep

质粒、酵母克隆载体

yep叫做附加体型质粒，又称游离型质粒(yeast episomal plasmids或yeast extrachromosomal plasmid)，是一种具有代表性的酵母克隆载体。yep是一种罕见的真核细胞质粒，一般由大肠杆菌质粒、2μm质粒以及酵母染色体的选择标记构成，属自主复制型质粒。2μm质粒是酿酒酵母一个长度为2μm的内源质粒。

酵母

YEps是一种罕见的真核细胞质粒，一般由大肠杆菌质粒、2μm质粒以及酵母染色体的选择标记构成，属自主复制型质粒。2μm质粒是酿酒酵母一个长度为2μm的内源质粒。它的DNA分子通常与蛋白质结合构成复合物。2 μm质粒含有自主复制起始区(ori)和STB区，STB序列能够使质粒在供体细胞中维持稳定。利用2μm质粒，人们已经构建出许多YEp型载体。YEp型载体PYF92由酵母的2μm质粒、pBR322质粒和酵母His3+(组氨酸)基因构成的。YEps对酵母细胞具有很高的转化活性，一般为103～105转化子/μg DNA。它在细胞内的拷贝数为70～200个。

YEps比YRp型质粒更稳定，性质和细菌质粒载体非常相似，惟一不同的是转化细胞的筛选方法。YEp与YIp的主要区别是多一个2μm质粒上的复制原点，因此具有在酵母菌细胞内自主复制的能力。使用YEps时，主要通过受体细胞营养要求的变化鉴别转化细胞与受体细胞。由于利用YEps克隆的基因容易在细胞继代培养过程中丢失，因而，人们常用YIps替代YEps。不过，作为酵母菌的克隆载体，YIps的转化频率很低。

构建

酿酒酵母基因组上每隔30～40 kb便有一个ARS，因此用不含复制子结构的整合型质粒构建酵母染色体DNA基因文库，很容易克隆到ARS片段。ARS能使重组质粒的转化效率大幅度提高，但提高程度差别很大。来自同一酵母菌种的绝大多数ARS不能交叉杂交，但ARS序列中AT碱基对的含量都很高(70%～85%)，并存在着一个拷贝的核心保守序列：(A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T)。这个核心序列改变一对碱基，均可导致复制功能丧失。

但核心序列并不是进行复制功能的最小单位，其上游和下游邻近区域的存在也是必需的。在一般情况下，具有完整自主复制功能的ARS大小在0.8～1.5 kb内。酵母自主复制型载体质粒的构建主要包括引入复制子结构、选择标记基因、克隆位点三部分DNA序列。复制子结构的来源有两种，即直接克隆宿主染色体DNA上的ARS或选用2μ质粒的复制子。由染色体ARS构成的质粒称为YRp(图1)，而由2μ质粒构建的杂合质粒为YEp(图1)。YRp和YEp质粒在转化酿酒酵母后，都能进行自主复制，拷贝数最高时可达200/个细胞。但转化子经过几代培养后，质粒的丢失率高达50%～70%，其主要原因是质粒的复制拷贝不能在母细胞和子细胞中均匀分配，而且这种不均匀分配现象发生的强度与质粒的拷贝数呈高度正相关。在麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)和脂解雅氏酵母(Yarrowia lipolytica)中．YRp型的质粒在每个细胞中只有2～5个拷贝，但却显示出较高的稳定性。有些YRp质粒在二倍体细胞中比在单倍体细胞中更为稳定，但其拷贝数比在单倍体细胞中减少5～10倍。

酵母质粒载体

酵母质粒载体是基因表达载体的一种，既可以在大肠杆菌中、又可以在酵母系统中进行复制与扩增，所以也称为穿梭载体。它分为整合载体和自我复制载体两类。①整合载体：它带有一个酵母URA3标志基因和大肠杆菌的复制和报告基因。由于质粒DNA与酵母基因组DNA之间发生了同源重组，在转化的细胞中可以检测到质粒的整合复制。整合载体中的YIp载体(yeast integrating plasmid)的转化效率低，而且不稳定；②自我复制载体：该类载体在酵母中可以自我复制，主要有YRp(yeast replication plasmid)、YEp(yeast extrachromosomal plasmid)和YCp(yeast centromere plasmid)。YRp在遗传学方面极不稳定；YEp可以很快与酵母内源质粒重组，重组后YEp载体很快复制并扩增。YCp质粒的遗传特性是拷贝数少且遗传性稳定；③酿酒酵母载体系统：酿酒酵母在基因工程技术操作中，作为克隆宿主或作为调节表达序列(如RNA聚合酶识别位点及核糖体识别位点)的克隆载体，其应用广泛。在酵母细胞核中某些自我复制型质粒(如大肠杆菌质粒)也能获得高拷贝。如在酵母中最大限度的表达基因，需要特异的启动子，如乙醇脱氢酶、同工酶一1、磷酸甘油激酶、酸性磷酸酶和α因子等基因的启动子等。通过DNA重组技术，还可以利用酿酒酵母生产外源蛋白。乙型肝炎疫苗就是利用酵母为宿主得到的第一种医用蛋白，另外组织型血纤维蛋白溶源激活因子、胰岛素和水蛭素等蛋白质产品也是利用酵母为宿主细胞生产的。

在实验方案设计中由于酿酒酵母不能对真核内含子进行识别和处理，因而外源基因须使用cDNA，产物蛋白是在胞内表达还是向外分泌也是十分重要的，因为这关系到基因工程下游工程的工艺设计。采用酿酒酵母表达系统还要注意选择适当的启动子和终止子；考查表达盒的稳定性；针对外源蛋白质积累部位的不同，采取相应的处理步骤；还要注意提高产量。

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