二维凝胶电泳

蛋白质分离技术

二维凝胶电泳(two—dimensional gel electrophoresis，2一DE)是蛋白质组研究中最有效的分离技术。它由两向电泳组成，第一向是以蛋白质电荷差异为基础进行分离的等电聚焦凝胶电泳，第二向是以蛋白质分子量差异为基础的SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳。

技术简介

二维凝胶电泳(two—dimensional gel electrophoresis，2一DE)是蛋白质组研究中最有效的分离技术。它由两向电泳组成，第一向是以蛋白质电荷差异为基础进行分离的等电聚焦凝胶电泳，第二向是以蛋白质分子量差异为基础的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。

双向凝胶电泳技术最先是由O’Farrell于1975年所描述，其原理是在相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，运用等电聚焦电泳和SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳把复杂的蛋白质成分分离和展现在二维平面上。

1、等电聚焦凝胶电泳

是依据蛋白质分子的净电荷或等电点进行分离的技术。在等电聚焦过程中．电场所采用的载体两性电解质含有脂肪族多氨基多羧酸，可在电场中形成正极为酸性，负极为碱性的连续pH梯度。蛋白质分子在一个载体两性电解质形成的连续而稳定的线性pH梯度中电泳，当蛋白质迁移到其等电点位置时．净电荷为零．在电场中不再移动．因此可将各种不同等电点性质的蛋白质分离开来。

2、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳

十二烷基硫酸钠(SDS)是一种阴离子去污剂，它能与蛋白质的疏水部分结合，从而使蛋白质获得负电荷，这种大量的负电荷基本上屏蔽了没有SDS时正常存在的任何一种电荷，使得在SDS-PAGE时，电泳迁移率仅与分子大小相关，由此使不同分子量的蛋白质得以分离。

技术原理

蛋白质的分离

所应用的二维凝胶电泳体系其原理是根据蛋白质的两个一级属性，即等电点和相对分子质量的特异性，将蛋白质混合物在电荷(采用等电聚焦方式)和相对分子质量(采用SDS—PAGE方式)两个方向上进行分离。蛋白质混合物在第一维方向上的分离是利用蛋白质等电点的不同在大孔凝胶中将蛋白质分离开，这一过程被称作等电聚焦。蛋白质是两性分子，根据环境pH的不同分别带正电、负电或零电荷，在pH高于其等电点的位置时，蛋白质带负电，反之带正电。在电场作用下，蛋白质分子会分别向正极或负极漂移，当达到与其等电点相同的pH位置时，蛋白质不带电，就不再发生漂移。根据此原理，开始的等电聚焦在凝胶中预先由小分子载体两性电解质形成pH梯度。载体两性电解质是一些可溶性的两性小分子，它们在其pI附近有很高的缓冲能力。当电压加在载体两性电解质混合物之间时，最高pI值的分子(带正电荷最多的分子)移向阴极，最低pI值的分子(带负电荷最多的分子)移向阳极，其余分子将根据其pI值在两个极值之间分散，形成一个连续的pH梯度；当蛋白质迁移至与其等电点相同的pH位置时，带电状态达到平衡，不再迁移，结果等电点不同的蛋白质分子得到分离。蛋白质带电状态取决于其二级结构，因此，没有完全去除二级结构的蛋白质，就可能会产生连续分布的带电状态各异的同一蛋白质的各种构象，从而在2一DE胶上产生条纹现象而降低分辨率。因此，要达到最好的分辨率，蛋白质必须充分变性，如在9moL/L尿素和70moL/L二硫苏糖醇条件下变性。

蛋白质混合物在第二维方向上的分离是按照蛋白质的相对分子质量的大小进行分离。蛋白质是带电的生物大分子，在第二维方向按其相对分子质量分离时，为了消除电荷的干扰，需要采用十二烷基硫酸钠(SDS)对蛋白质进行变性处理。在2一DE谱上所看到的是不完整的蛋白质亚基分子，而SDS是一种强离子去污剂，作为变性剂与助溶性试剂，可以断裂分子内与分子间的氢键或其他非共价键，使分子变性，破坏蛋白质分子的=级结构与三级结构；同时，强还原试剂巯基乙醇和二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚成它的多肽链。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质SDS胶束，所带的电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。因此这种胶束在SDS—PAGE中的电泳迁移率不受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基的大小。

分离胶的染色

二维凝胶电泳分离后的蛋白质点经显色后才能被鉴定。二维凝胶电泳中的显色是一个重要的步骤，常用的非放射性染色方法中最灵敏的为银染法，其灵敏度可达到1 ng甚至更低；其次是荧光染色以及铜染、锌一咪唑负性染色、考马斯亮蓝染色等，后者染色灵敏度为50～100ng。由于银染凝胶的质谱鉴定较难，附着在凝胶基质上的肽片段胶内提取效率较低，因此，大多实验室用银染寻找差异蛋白质点，再加大上样量，进行考马斯亮蓝染色，结合胶内酶切提取鉴定蛋白质。

分离胶的图像分析

图像分析也是2一DE研究的重要方面。获得蛋白质二维凝胶电泳图像后，要对凝胶图像进行备份保存，以数字化图像的形式将其存储下来，而且要尽量完整地保留其定性和定量信息，以利于进一步的分析。通过对批量二维凝胶图谱的分析，应该获得的信息包括每一块凝胶中分离得到的总蛋白质点数、凝胶之间的批次重珊陛、蛋白质点的缺失和出现以及多块胶之间蛋白质点的表达丰度的定量变化。这些工作仅仅依靠眼睛的分辨能力来完成是不现实的。要对上千个蛋白质点进行分析，只有依赖于凝胶图像分析软件。已有数种商业化的图像处理软件包，可以方便地处理二维凝胶电泳图谱。

现在进行二维凝胶电泳结果图像分析时，均采用计算机软件比对。为了准确地比较分析，必须采用校正标准化的方法：①强度校正，在扫描前，使用灰度尺解决图像扫描设备的非线性应答问题，同时可把图像中的像素值转换为实际的光密度。②匹配时，可建立平均凝胶，即通过把一组凝胶经统计学处理合并在一起生成的模拟凝胶。创建平均凝胶可在同一样品的一组凝胶中生成一张有代表性的凝胶。当比较两个不同的样品时，用平均凝胶可以获得更多的信息，且更具有稳定性，通过计算机处理得到一个可信的结果。在现在的图像分析过程中，虽然有计算机取点、匹配，但仍然需要进行人工校对。因为计算机会将背景误认为是蛋白质点，或漏掉胶上颜色较淡的点，也会将多个蛋白质点看成一个点，这些都必须经过手工凋整，耗时耗力，增加人为误差。所以，二维分析软件的灵敏度、精确度、分辨率、自动化都有待于进一步提高。

特别值得一提的是二维电泳凝胶上的点与蛋白质并不具有一一对应关系。这是由于：①同一基因有不同的表达产物；②同一蛋白质因不同的结构修饰而产生不同的斑点；③同一蛋白质因降解而成多个蛋白质碎片斑点。

技术步骤

二维凝胶电泳技术主要包括四步：①样品的制备；②等电聚焦；③SDS—PAGE；④染色和分析结果。

样品的制备

样品制备是二维凝胶电泳中最关键的一步，它将直接影响二维电泳的结果。由于样品来源千差万别，对于每一个样品来讲，最好的提取蛋白的方法要通过多次实验来摸索。理想状态应使样品中的蛋白能完全溶解、解聚、变性、还原。

为了提高蛋白的溶解性，多采用蛋白质分步提取方法。即以三种分别适合溶解高、中、低亲水性蛋白质的裂解液分步提取细胞中的蛋白质组分：第一步，水溶液提取；第二步，含Urea—CHAPS—DTF的溶液提取；第三步，含硫脲一SB3—10一TBP的溶液提取。分步提取法可提高疏水蛋白的提取率和蛋白质的分辨率，而且对待鉴别的蛋白质斑点能提供更多的信息。还有对样品进行预分级分离，可更有效地利用样品，检出更多的蛋白质组分，但有分离不完全、分离产量低及蛋白质之间的交叉污染等缺点。

第一向等电聚焦

等电聚焦(IEF)是在一条宽3mm的IPG干胶条上进行，样品溶解在泡涨液中，一起加在胶条上。固相pH梯度胶条(IPG)由Bjellqvist在1982年报道，在这之前，经典的2一DE第一向是用管状胶在载体两性电解质溶液造成的pH梯度中进行。由于CA所形成的pH梯度不连续，所以在电泳过程中容易产生PH梯度漂移，再加上蛋白上样量偏低，使得2一DE的结果重复性不佳，不能在一块胶上分析大量蛋白质，限制了2一DE的应用。IPG干胶条的出现是二维凝胶电泳重新兴起的重要原因。它是将两性分子在胶聚合时就形成pH梯度固定在凝胶条上，胶条背面有塑料支撑膜。IPG干胶条的优点有：①pH梯度稳定，聚焦准确，精确度高，梯度分辨率可达0.001pH。②可根据实验需要选择不同的pH范围，分离更多的酸性和碱性蛋白。Wildgruber报道，采用窄pH胶条(pH3.5～6.7，lpH单位)，可将观察到的酵母蛋白点总数从755个增加到2286个。③无阴极漂移、碱性蛋白丢失的现象。④塑料支撑膜防止凝胶条伸长或破裂，使实验更容易操作。⑤蛋白上样量更高，可达1～2mg，是两性电解质等电聚焦上样量的10倍。⑥样品中盐的干扰少，无边缘效应。⑦实验具有可重复性。

在等电聚焦过程中，电压逐渐上升，低电压使蛋白能更好地转移至胶条中，高电压使蛋白在电场中运动至它的等电点位置。一般等电聚焦需16～2dh，因为蛋白质在接近它等电点位置时迁移相当缓慢。等电聚焦结束后，IPG胶条需经平衡后才能进入第二向SDS—PAGE。

第二向SDS—PAGE

SDS—PAGE是根据蛋白质的相对分子质量来分离蛋白。SDS(十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺)是一种阴离子去污剂，包围在蛋白质周围，形成过量的负电荷，去除电荷的影响；SDS也能破坏氢键、蛋白质间的疏水键，使蛋白部分去折叠，减少蛋白质第二、第三结构对相对分子质量的影响，而只能根据蛋白质的相对分子质量分离蛋白。

可根据实验的不同选择大小不同的胶，并最多能进行12块胶同时电泳，减小了实验误差。

染色和图像比对

凝胶染色多采用硝酸银染色、考马斯亮蓝染色、放射性荧光染色。放射性荧光染色灵敏度最高，可检测到10-6mg/L浓度级的蛋白。硝酸银染色灵敏度也较高，可达4ng，但进行质谱分析时不易去除银离子。考马斯亮蓝染色灵敏度不如硝酸银染色，但操作简便，可进行定量分析，做质谱时多用该法。现在实验室一般的方法是：进行多次二维凝胶电泳，硝酸银染色后寻找蛋白差异点，再行考马斯亮蓝染色，找出相对应的蛋白差异点，做质谱分析。还有的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF膜上后再进行分析，确定它们是已知蛋白还是未知蛋白。

评价与应用

双向凝胶电泳技术主要用于分离细胞或组织蛋白质提取物，构建特定细胞或组织蛋白质的二维电泳图谱，分析特定条件下蛋白质的表达状况，进行差异电荷分离过程即等电聚集与质量分离过程结合到一起，以期获得细胞内的全部基因产物。其完整步骤应包括样品制备、等电聚焦、平衡转移、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳、斑点染色、图像捕获和图谱分析等。

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