免疫色谱法

分离纯化技术

免疫色谱法又叫做免疫亲和层析技术，是发明于20世纪50年代的一种分离纯化技术，但直到80年代末人们才真正认识到该项技术的价值，其应用不再局限于单纯对生物大分子的分离纯化，并深入到目标产物定性与定量分析中，因而近30年得到迅速发展，在分析领域被广泛应用，成为一种安全、快速、高效的免疫学检测技术。

定义

免疫色谱法是基于具有高度亲和性和专一性的特异性抗原抗体结合反应，将抗原或是抗体偶联到柱填料中制备亲和层析柱，样品通过层析柱，即可快速而高效的从复杂的混合样品中分离纯化出与抗原或抗体互朴的特定的免疫成分，是选择性最高和最有效的分离纯化方法，且具有专一分离纯化特异性抗体的能力。

近30年免疫色谱法得到迅速发展，在分析领域被广泛应用，成为一种安全、快速、高效的免疫学检测技术。

免疫亲和柱的制备

抗原或抗体的制备与纯化

成功的免疫亲和依赖于特定性质的抗原或抗体的选择，高度被纯化的抗原或抗体能够提供高度特异性配基来纯化抗体或抗原。配基溶液的浓度和纯度严重制约着亲和纯化的效果，选择和制备亲和柱的配基要兼备高纯度、高活性和高度特异性。

载体的选择

免疫亲和层析的成功与否很大程度上取决于选择一个合适的载体，理想的载体应具有以下性质：

①具有大量可供活化的能与配基特定结合的化学基团，并且在温和条件下能够与大量的配基反应连接而不破坏配基性质。

②载体必须具有较好的物理稳定性、化学稳定性及生物惰性，可耐受偶联、亲和、洗涂、洗脱、平衡等各操作条件下的处理而不改变其结构、硬度、膨胀度等，非特异性吸附现象尽量不发生。载体需具备良好的机械性能，耐受较宽pH及离子强度、颗粒均匀、膨胀性能好，常用的载体有琼脂糖凝胶、纤维素、聚己稀凝胶及聚丙烁酌胺凝胶等等。

③载体必须有特定的结构（稀疏的网状结构）能使配基大分子自由进入而增加亲和层析柱中配基的有效浓度。商度多孔性质使网状结构能够保证各类大小分子的自由流动，也间接提高了配基及配体的亲和有效浓度，使免疫亲和体系更趋近于溶液中的反应状态。

④载体需具有离度的亲水性及水不溶性，载体的亲水性能够在一定程度上保证被免疫亲和吸附的生物分子的稳定性，还可有效减少因疏水作用等其他作用造成的非特异性吸附，保证亲和反应平衡。

抗原或抗体与载体的结合

抗原或抗体要偶联到载体上，需要先将载体的功能基困活化，再进行偶联。偶联反应必须在不致使破坏取基的理化性质的温和条件下进行，偶联后多次洗涂载体，除去未偶联到载体上的抗体，另需测定偶联的配基量，计算偶联率。

应用

免疫亲和层析技术因其安全、简便、可定呈定性分析等优点，近20年来得到迅速发展，应用范围也日益扩大，国内外已先后有文献报道研制出免疫亲和层析柱，如生长激素单克隆抗体免疫亲和柱、黄曲霉素免疫亲和柱、氛霉素免疫亲和柱等，其应用主要包括抗体抗原的分离纯化,结合HPLC、GC等方法进行药物检测、激素检测、农兽药残留检测及其他毒素检测等等。

展望

免疫亲和层析技术可从样品粗提液中一次性简单过柱处理即可分离出巧需的高纯度特异性活性物质，不但可分离样品中含量极微的物质，而且可分离性质相近的目标物质。当然，免疫亲和层析也存在一些缺点，如当前载体发展不足导致价格昂贵，配基纯度要求过高不易制备，洗脱过程中易造成目的物质的失活等。制备免疫亲和柱是较为昂贵的，虽巧其产物纯度极高，但当前文献报道亲和柱结合容量相对偏低，因此在保证效率的前提下为了节约成本，通常制备的是容量小而粗的柱子。同时研究其柱容量、稳定性、重复性、上样条件、洗脱条件等也是必要的，多次利用分离纯化更多的目的产物，且柱体短小可降低偶联配基的丢失和损耗。

新种类柱填料和载体的研究开发，偶联配基的高纯度制备（抗原或抗体）及如何保证配基及目的产物在免疫亲和层析过程中的活性不丧失，将会严重影响着该项技术的发展。

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