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全内反射荧光显微镜

全内反射荧光显微镜

全内反射荧光显微镜（total internal reflection fluorescent microscope，TIRFM），利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200nm以下。因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测标的，故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。

技术简介
因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测标的，能帮助研究者获得高质量的成像质量和可靠的观测数据。故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。
光学原理
当一束光从光密介质进入光疏介质时，根据斯涅耳定律一部分光会发生折射，而一部分光会发生反射，当入射角度不断增大，折射角也会不断增大，当折射角刚好达到90度时，就发生了全反射现象。全反射发生后，折射光有一个临界状态沿着折射面传播，这部分光称之为隐失波，其能量在Z轴上呈现指数衰减。
技术分类
TIRFM的实现是通过改变激光的入射角来实现的，按技术TIRF显微镜分为两种：棱镜型和物镜型。
棱镜型TIRF显微镜采用棱镜产生衰逝波，并用物镜收集荧光成像。
物镜型TIRF显微镜采用大数值孔径物镜产生衰逝波，同时采用物镜收集荧光成像。与棱镜型TIRF显微镜相比，物镜型TIRF的应用更为广泛。
全内反射
全内反射，又称全反射（英语：total reflection）是一种光学现象。当光线经过两个不同折射率的介质时，部分的光线会于介质的界面被折射，其余的则被反射。但是，当入射角比临界角大时（光线远离法线），光线会停止进入另一界面，反之会全部向内面反射。
这只会发生在当光线从光密介质（较高折射率的介质）进入到光疏介质（较低折射率的介质），入射角大于临界角时。因为没有折射（折射光线消失）而都是反射，故称之为全内反射。例如当光线从玻璃进入空气时会发生，但当光线从空气进入玻璃则不会。最常见的是沸腾的水中气泡显得十分明亮，就是因为发生了全内反射。
克普勒（Johannes Kepler，1571-1630）在公元1611年于他的著作Dioptrice中，已发表内部全反射（total internal reflection）的现象。
优势
将高清晰图像与使用简便的系统，以及广泛的宽视野显微镜应用相结合。研究者使用该显微镜除了可以完成从高速成像到TIRF的日常试验之外，还可以获得超清的影像。
独特的全内反射荧光功能
独特的全内反射荧光功能可在多色实验过程中，通过改变波长以智能方式弥补穿透深度，对消散的视野方向进行全自动校准和选择，以确保获得质量最佳的全内反射荧光图像与可靠的实验数据。
动态扫描仪
动态扫描仪可精确定位激光束，并决定消散视野的准确穿透深度。
缩短培训时间
使用一些特殊的荧光软件如徕卡 AF7000 荧光软件可全面控制全内反射荧光系统，包括校准与所有显微镜功能，确保减少培训的时间以尽快投入到科学研究中。
高级荧光工作站
完全集成的全内反射荧光系统可与徕卡显微系统有限公司的高级荧光工作站结合使用，以在有多位用户的实验室中，满足各种成像需要。
高质量图像
联合全内反射荧光（TIRF）与快速荧光共振能量转移（FRET） 分析技术，适用于细胞膜分析或单分子结构分析；小泡跟踪、荧光活细胞成像或延时成像与其它功能确保生成高质量的图像，从而显著提高了科学研究的结果。
主要应用
TIRF显微镜主要用于微小结构和单分子成像，如细胞膜上单个蛋白质动力学研究、钙离子探测、药物跟踪和细胞结构成像等。
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