全基因合成

对于分子较小而又不易得到的基因采用该方式

全基因合成:一般对于分子较小而又不易得到的基因采用该方式。可将X链基因分成若干寡核苷酸单链片段(尤其待合成基因在100 个核苷酸以上时)，每个片段长度控制在40~60个碱基，并使每对相邻互补的片段之间约有6 个碱基交叉重叠。在体外将除基因两端末端外的所有片段磷酸化。混合退火后加入DNA 连接酶，即可得到较大的基因片段。如果需连接亚克隆的方法，最后将亚克隆的较大片段重组为完整的基因。采用分步连接、亚克隆的方法时，为便于从亚克隆中回收基因片段，应在片段两侧设计合适的酶切位点。由于每个亚克隆可以分别鉴定，因此可减少顺序错误的可能性。

简要介绍

DNA又称去氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分，同时也是组成基因的材料。有时被称为“遗传微粒”，因为在繁殖过程中，父代把它们自己DNA的一部分复制传递到子代中，从而完成性状的传播。DNA是十分庞大的生物分子。病毒含有几千到几十万个核苷酸，原核生物的DNA分子平均为10E6个碱基对，真核生物的DNA分子可达l0E9个碱基对。

按每个基因平均为1000个碱基对进行粗略的计算，大肠杆菌约有3000－4000个基因，而人类细胞的基因数目可高达200万个。虽然其中某些基因，特别是真核细胞内的一些基因是多拷贝的，在基因组内有多个甚至极多个重复，实际基因数要比上述推算的基因数要少得多。尽管如此，原核细胞和真核细胞基因组内的基因数目仍然是极为惊人的。

人工合成

由于研究某些基因或者某种蛋白的生理作用，例如生理活性等，因此，需要通过人工实验的方法合成一段全基因序列。

有效方法

经过基因工程学工作者艰苦细致的探索研究，人们现在已经掌握了分离和制造目的基因的一些有效方法。一般来说，目前获取目的基因的方法主要有三种：反向转录法、从细胞基因组直接分离法和人工化学合成法，这些方法都有一个前提，就是已有文献报道所研究的目的基因的蛋白序列或者基因的序列。

1、反向转录法

这种方法主要用于分子量较大而又不知其序列的基因，它以目的基因的mRNA为模板，设计上下游引物，借助反转录酶合成碱基互补的DNA片段，即cDNA，再在DNA聚合酶的作用下合成双链cDNA，亦即目的基因的双链DNA。

2、基因组扩增法

利用基因组抽提试剂盒，可以从细胞、植物、血液、动物组织中直接分离基因组，设计特异扩增的引物，利用抽提的基因组为模版，直接PCR扩增，以获取目的基因。

3、人工合成

依照某一蛋白质的氨基酸序列，或基因序列，设计全长引物，利用OVERLAP方法形成模版DNA，再利用PCR扩增的方法得到双链DNA，然后将PCR产物转化克隆至克隆载体或者表达载体中。化学合成全基因目前是准确率最高，速度最快的方法，同时可以依据密码子在不同宿主细胞的偏爱性和不同的实验需求，设计基因序列，提高表达水平。

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