鸟枪法

直接从生物细胞基因组中获取目的基因的方法

鸟枪法(Shot gun)是一种直接从生物细胞基因组中获取目的基因的方法。鸟枪法将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的DNA片段，分别连接到载体DNA上，转化受体细胞，形成一套重组克隆，从中筛选出含目的基因的目的重组子。此法操作简单，但工作量大。

简介

鸟枪法是直接从生物细胞基因组中获取目的基因最常用的方法。它用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，使供体细胞提供的DNA(即外源DNA)的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。此方法操作简便，但工作量大。

它的好处是速度快，在很短的时间里就能拿到生物细胞基因组(例如人类基因组95% 的序列)。该法的思路独特，好像树林里停了一大群鸟，很多人乱枪射击，在很短的时间内，就可以将林子中的大部分鸟打中。鸟枪法又有点类似人们玩的拼图游戏。拼图游戏是将一个完整的画面分成杂乱无章的碎块,然后重新拼装复原。而“鸟枪法”则是先将整个基因组打乱，切成随机碎片，然后测定每个小片段序列，最终利用计算机对这些切片进行排序和组装，并确定它们在基因组中的正确位置。

原理

“鸟枪法”是一种由生物基因组提取目的基因的方法。首先利用物理方法(如剪切力、超声波等)或酶化学方法(如限制性内切核酸酶)将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，继而将这些片段与适当的载体结合，将重组DNA转入受体菌扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某一基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。

这种方法也就是应用基因工程技术分离目的基因，其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。可以说这是利用“溜散弹射击”原理去“命中”某个基因。由于目的基因在整个基因组中太少太小，在相当程度上还得靠“碰运气”，所以人们称这个方法为“鸟枪法”或“散弹枪”实验法。

基本流程

目的基因组DNA片段的制备

按照常规方法从作为供体的生物细胞中分离纯化其染色体DNA，在一般条件下，由于分离纯化操作中的物理剪切作用，制备出的染色体DNA片段平均大小在10～-200kb左右。然后将染色体DNA用下列方法切成片段，以便与载体分子进行体外重组。

(1)机械切割。供体染色体DNA可用机械方法(如超声波处理等)随机切割成双链平头片段，采取合适的超声波处理强度和时间可将切割的DNA片段控制在一定范围内，其上限为载体的最大装载量，而下限应大于目的基因的长度，否则无法在一个重组克隆中获得完整的目的基因。一胺来说，原核生物的基因长度大都在2kb以内，真核生物的基因长度变化很大，最大的基因可达1001kb以上，因而将外源DNA片段处理成略小于载体装载量上限的长度始终是正确的，因为每个重组克降中所含的外源DNA片段越大，后续选的规模就越小。当染色体DNA上目的基因区域的限制性酶切图谱未知时，机被切割是制备待克隆DNA片段的首选方法，但由于这些DNA片段具有随机平头末端，因此必须插入载体DNA的平头限制性酶切位点上，而且克隆的外源DNA片段很难完整地从重组分子上卸下。

(2)限制性内切酶部分解。采用识别序列为四破基对的限制性内切酶(如MbolSaa3A、Alal等)部分降解染色体DNA，也可获得大片段的DNA分子。由于这些限制性内切酶的识别顺序在任何生物基因组中频繁出现，因此只要采取合适的部分酶解条件同样可以获得一定长度的DNA随机片段，而且经部分酶解获得的DNA片段具有黏性末端，可以直接与载体分子拼接。

(3)特定限制性内切酶全酶解。如果染色体DNA中目的基因的两侧拥有已知的限制性内切酶识别位点，而且两者之间距离不超过载体装载量的上限，那么用这一种(或两种)限制性内切酶全酶解染色体DNA片段可能更为有利，所产生的DNA片段呈非随机性，在某些程度上可以简化后续的重组和筛选操作。同时，重组分子可用相同的限制性内切酶完全切下插入片段，这使得利用限制性酶切图谱法直接筛选目的重组子成为可能。

外源DNA片段的全克隆

根据外源DNA片段的末端性质及大小确定克降载体，鸟枪法一般选择质粒或入-DNA作为克隆载体，受体细胞大多选择大肠杆菌，只有当后续筛选必须采用外源基因表达产物检测法时才选择那些能使外源基因表达的相应受体系统。

目的重组子的筛选

从众多的鸟枪法克隆中快速检出目的重组子的最有效手段是菌落(菌斑)原位杂交法或外源基因产物功能检测法，前者需要理想的探针，后者则依赖于简便筛选型的建立。如前所述，若克隆淀粉酶、蛋白或抗生素抗性基因，利用外源基因产物功能检测法筛选目的重组子是最理想的选择。在既无探针又难以建立快速筛选模型的情况下，也可采用限制性酶切图谱法对所获重组克隆进行分批筛选。例如，已知目的基因位于2.8kb的 ECORI DNA片段中，可用 ECORI分别酶解所有的重组分子，初步确定含2.8kb限制性插入片段的重组克隆，然后再根据目的基因内部的特征性限制性酶切位点进行第二轮酶切筛选，最终找到目的重组子。

目的基因的定位

在绝大多数情况下，利用鸟枪法获得的目的重组子只是包含目的基因的DNA片段，必须通过次级克隆在已克隆的DNA片段上准确定位目的基因，然后对目的基因进行序列分析，搜寻其编码序列以及可能存在的表退染色体DNA调控序列。鸟枪法克隆目的基因的工作量之大是可想而知的，对目的基因及其编码产物的性质了解得越详尽，工作量越小。

应用

“鸟枪法”最初主要用于测定微生物基因组序列。近年来，利用改进的全基因组“鸟枪法”完成了果蝇和人类基因组的测序工作，证明了它在测定大基因组上的可行性和有效性。

2001年7月，我国杂交水稻基因组计划正式展开，首先以杂交水稻的父本即纯种籼稻93-11为研究对象。与国际水稻基因组计划不同，这一研究采用全基因组“鸟枪法”策略进行测序。

特点

“鸟枪法”优点是速度快，简单易行，成本较低。但用它来测序，最终排序结果的拼接组装不太容易。中国科学家设计出了一种序列组装软件，能有效克服“鸟枪法”全基因组测序组装过程中的困难。

在研究中，他们首先在整个水稻基因组上生成许多已知长度的DNA（脱氧核糖核酸）切片，然后使它们按DNA序列的重合区域进行排列。这些切片数量足以覆盖水稻基因组4次。科学家们接着确定每个切片的碱基对序列，并用计算机程序将其组装成更长的片段，然后将这些片段排序、装配成10万多个被称为支架的更大组件。

他们设计出的软件重点是通过支架水平上的接近来进行组装，并采取了独特的重复序列处理算法，可识别并暂时屏蔽占水稻基因组约40%的重复序列。这样做的好处是既能减少计算量，又最大限度降低了错误拼接的可能性。

美国珀杜大学植物遗传学家贝内特泽恩评价说，中国科学家的水稻基因组计划，“提供了一个有关鸟枪测序法速度和效率的极好范例”。

适用范围

真核生物在基因表达时，结构基因中的内含子不能指导蛋白质的合成。所以真核生物的目的基因不能用“鸟枪法”获得。真核生物基因大都由有编码功能的序列——外显子和无编码功能的序列——内含子，两者比例为1：4构成。鸟枪克隆法在基因组DNA文库中筛选到的目的基因，与染色体中的天然基因是一样的，含有内含子，在结构基因两端的连接区还有转录调控序列片段，即调节基因。这样的基因可供基因表达的调控分析。因为有内含子的存在，这样获得的结构基因不宜在原核宿主组织中表达。所以，要获得真核生物的目的基因，准确的说要获得真核生物目的基因的编码序列，不宜用鸟枪法。

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