共聚焦显微技术

共聚焦显微技术是近十几年迅速发展起来的一项高新研究技术，目前应用领域扩展到细胞学、微生物学、发育生物学、遗传学、神经生物学、生理和病理学等学科的研究工作中，成为现代生物学微观研究的重要工具。

简介

共聚焦显微技术是在荧光显微分析技术的基础上发展起来的，利用荧光显微镜可以对生物样品发出的荧光进行观察和分析，但是荧光显微镜收集到的是样品的整体荧光，来自样品内不同部位的荧光信号相互干扰。难以区分，无法获得准确的定位和定量信息。共聚焦显微技术的出现很好地解决了这一问题，这一技术可以获取细胞内某个薄层面上的荧光信息，而该层以外的信号被消除掉，成像清晰程度大大提高；结合计算机自动控制，可以对荧光信号的分布、强度和动态变化进行全方位的分析，得到丰富的信息。

与传统显微镜相比共聚焦显微镜可抑制图像的模糊，获得清晰的图像；具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片；增加侧向分辨率；由于点对点扫描去除了杂散光的影响。

共聚焦显微镜原理

共聚焦显微镜利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔内，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即为共焦点，被探测点所在的平面即为共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面的连续光切图像。

共聚焦显微镜实现方式

目前共聚焦的实现有两种方式：激光共聚焦和数字共聚焦。

激光扫描共聚焦

这种共聚焦技术利用激光作为激发光源，将激光聚焦于样品中的某一点，这样只有该点附近的区域有荧光，其他没有被激发的部位没有荧光，这一区域发出的荧光反射到光电倍增管，在光电倍增管前设有1 个计算机控制的可调节针孔，保证只有被激发点发出的荧光才能到达光电管，而附近其他点所发出的荧光被挡在视野之外。采用计算机控制激光和针孔，对细胞内的某一层面进行扫描，可以获得清晰的二维图像。

这一技术成像速度快、自动化程度高。但激光具有单色性，一种激光器只能发出某几个特定波长的激光，而荧光染料的种类很多，其激发光波长各不相同，这样在使用某种型号的激光器时，只有少数几种荧光染料可以使用，而其他大多数的染料不能使用；目前同时配备数个不同激光器或多光子脉冲激光器的激光共聚焦系统的出现，虽然可以解决这一难题，但是设备结构复杂、价格昂贵，维护保养要求较高。

数字共聚焦

这一技术是随着计算机软件技术的发展出现的，与激光共聚焦的原理有极大的区别，它在普通的荧光显微镜上加上1 个计算机控制的高分辨率、带有制冷装置(以提高信噪比) 的CCD 摄像机，摄像机获取的图像由计算机进行解卷积(deconvolution) 计算，这种数字式图像处理可以将聚焦平面以外的图形信号删除，保留高清晰度的焦平面信息。

这一系统硬件配备比较简单，价格远远低于激光共聚焦系统；由于使用可以发出连续光谱的高压汞灯或氙灯作为光源，使这一技术几乎可以用于所有的荧光染料，应用范围广泛，其机械部分组成简单，灵活性高。这一技术的不足在于其图像获取、计算对计算机的依赖性高，图象获取时间相对较长，实验时除要分析的层面被激发外，细胞内其他部位也被激发，增加了荧光染料的光淬灭，对某些容易被光淬灭的染料会造成明显的影响；随着计算机和摄像技术的发展，这些问题也在逐步解决。

共聚焦显微技术的相关技术

染色剂的选择

随着荧光分析技术的不断发展,化学合成、分子生物学技术的进步, 不断有新型的荧光染料被开发出来, 已经成功应用于生物学研究的染色剂可以用于对细胞膜、各种细胞器、细胞核、细胞骨架、细胞内游离离子(Ca2+、M g2+等) 和多糖等物质的染色。在实验之前首先确定要研究的目标, 针对研究者使用的共聚焦显微镜的类型正确选择所用染料的种类和形式。研究目的和材料不同, 选用的染色剂也各不相同, 除有关文献外, 有些荧光染色剂使用手册集中介绍了各种染色剂的化学结构、理化性质、用途、应用范围和具体使用方法, 在选择染色剂时可以作为参考。

染色技术

生物体内除了少数物质可以受激产生自发荧光之外, 大多数分子本身没有荧光, 必须借助于染色技术。常用的染色方法有以下几种。

孵育法

将样品浸泡于染色剂溶液中, 染料分子通过扩散作用进入细胞内, 与样品中的目的分子结合。这是应用比较多、也是最简单的方法, 在应用于经过固定处理的细胞结构染色时效果不错; 但是在活细胞染色时有时会因为细胞膜对染料的透性不够或染料分子太大而无法进入细胞内影响染色效果。

损伤导入法

这是应用难以自由透过细胞膜的大分子染料时常用的一类方法, 主要有显微注射法、电刺激穿孔导入法等, 利用各种手段在细胞膜上造成空洞以使染料进入细胞内。这类方法的主要优点是导入的成功率高、染料在细胞内的浓度有保证; 缺点是操作复杂繁琐、掌握起来有一定的难度, 不适合大量细胞的测定, 而且损伤处理可能会对细胞的生理活动造成影响。

转基因法

随着生物学的发展, 发现了一些生物体内存在着可以受光刺激产生荧光的蛋白质——发光蛋白, 如水母发光蛋白(能与细胞内游离钙离子结合)、绿色荧光蛋白等, 这些蛋白的基因已经被克隆出来用于制造转基因生物。除了可以直接将某些荧光蛋白的基因导入细胞表达外, 还可以把我们要研究的某些蛋白质的基因与这些荧光蛋白质的基因整合到一起, 使之一起表达合成并连接在一起, 共同存在于细胞内。对这些与目的蛋白结合在一起的荧光蛋白的荧光位置及强度进行分析, 可以获得目的蛋白在细胞内定位、在发育过程中表达合成的动态变化情况。目前可以用于显微注射的荧光蛋白、荧光蛋白基因、经过改造可供连接用的荧光蛋白基因片段乃至连接了荧光蛋白基因的某些目的蛋白基因都有商品出售, 大大方便了研究工作的开展。

图像及数据处理

样品经共聚焦显微镜观察得到图像及数据后, 图像和数据的加工处理是一项关键技术, 也是耗时费力的一步, 各个共聚焦显微镜生产厂家一般都有配套的图像加工和数据处理软件, 用法各不相同。除这些软件外, 一些通用的图像加工和数据处理软件也是数据及图形加工处理过程中经常用到的。

共聚焦显微技术的优点

成像清晰

由于利用光学或数字技术消除了聚焦平面以外的荧光信号的干扰, 使我们要分析的区域内的图像清晰度提高, 得到更为准确的定位和定量信息。

连续片层扫描及图像重组

共聚焦显微镜在计算机的控制下可以对样品中的不同层面进行连续逐层扫描, 以获得各个层面的图像, 层面之间的间距可以达到0. 1微米甚至更小, 在图像获得后由计算机自动将这些图形重组为三维图像。与普通光学照相机获得的图像比较,共聚焦所得到的重组三维立体图形清晰度高、层次分明、立体感更强, 通过计算机软件处理, 可以对三维图形进行任何形式的旋转, 可以从任何角度进行观察, 还可以对细胞内的某个选定结构进行长度、体积的测量和计算, 在分析细胞内的空间结构和某些物质在细胞内的精确定位方面具有明显的优势, 这也是共聚焦显微技术诸多功能中应用最广泛的一种。

多标记技术

利用共聚焦系统可以同时对利用两种或三种不同的荧光染料分别标记了细胞的不同结构(如分别标记染色体和细胞骨架系统) 的样品进行观察, 这样一次实验观察就可以获得细胞内不同结构的信息, 对不同结构组分的定位、相互联系方式进行研究。在最终获得的图像可以分开表示单个结构; 也可以将图片迭加在一起, 用不同颜色表示不同的结构, 更加直观, 这是普通荧光显微镜无法做到的。

活体观察

除了可以对固定标本的细胞进行观察外, 共聚焦显微技术还可以在不对细胞进行固定或其他损伤性处理的情况下进行观察, 获得活细胞内的信息, 显示在活体情况下细胞内的真实结构和生理学特征。更为重要的是利用共聚焦显微镜可以跟踪自然状态下或受某种因素刺激后活细胞内的结构和生理过程随时间变化的情况, 得到准确而直观的动态变化资料, 为分析细胞内的生理生化反应提供直接的实验数据。

获得数量化信息

共聚焦显微技术不仅能够对细胞内荧光进行定位, 还可以对其进行定量分析, 获得二维或三维空间内分布在样品不同部位的荧光强度数值以及荧光强度在各种处理条件下的变化情况。量化信息的获得是研究活细胞内生理生化反应时重要的手段, 而共聚焦显微技术在这一方面的优势是其他技术所无法达到的。

共聚焦显微技术的应用

共聚焦显微技术的应用范围包括形态学观察与测量、生物学测量蛋白质功能检测与包括在光谱测量中的其它方面的应用。

其中该技术在形态学的观察与测量方面包括亚细胞器定位，如最简单的二维定位、定量及三维定位、图像重组等。

生物学测量方面可以分为动态与静态的生物学测量，在动态与静态水平都可以同时检测活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化(Mg2+ 、Na+ 、K+等)、自由基的动静态水平、线粒体膜电位的动静态变化及蛋白质的转位（不过静态测量时需用固定样品）。此外，动态测量还可以对药物进入细胞的动态过程进行定位分布及定量。

蛋白质功能检测可分为蛋白荧光恢复的测量(FRAP)与FLIP、笼索解笼索的测量与动态/静态兼可的荧光能量共振转移(FRET)三种测量方式。

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