农杆菌

革兰氏阴性细菌

农杆菌是指生活在植物根表面依靠由根组织渗透出来的营养物质生存的一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。农杆菌主要有两种：根癌农杆菌和发根农杆菌。根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增生高度分支的根系。

简介

在自然界中，绝大多数的植物都是从土壤中生长出来的，它们从土壤中吸取营养和水分，同时也会被土壤中的各种细菌所侵染而致病。在众多的土壤细菌中，有两种农杆菌(Agrobacterium)一直是世界各国科学家们研究的热点，一种被称为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，另一种被称为发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。它们都是革兰氏阴性菌，同属于根瘤菌科(Rhizobiacease)。这两种农杆菌之所以受到重视，主要就是因为它们都携带有一种特殊的质粒，这些质粒都可以被用于植物基因工程的遗传转化研究中。

分类

农杆菌主要有两种：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，被誉为“自然界最小的遗传工程师”。可以通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技术，得到转基因植物。

农杆菌介导法

农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，农杆菌的介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。此外，生物技术学家还可以通过发根农杆菌转化，在液体培养基中培养高密度的根，作为一种在转基因植物中获得大量蛋白质的方法。

农杆菌Ti质粒的T-DNA可高效率地整合到植物受体细胞的染色体上并得到表达。利用这一特点，Marton等(1979)以植物原生质体为受体首创了“共培养法”(co-cultivation)。后来经过一系列改进，特别是Horsch等(1985)建立的“叶盘共培养法”(leaf discco-cultivation)，使这种转化方法更加实用。

所谓“共培养法”是指将根癌农杆菌与植物的原生质体、悬浮细胞、叶盘、茎段等放在一起共同培养而实现转化的方法。首先用打孔器从消毒的叶片上取得叶网片，亦称之叶盘，将其放在对数生长期的农杆菌的菌液中浸泡数秒钟后，置于培养基上共同培养2～3d。待叶盘周围的菌株生长至肉眼可见菌落时，转移到含有抑菌剂的培养基中除去农杆菌，同时在该培养基中加入抗生素进行转化体选择，经过3～4周的组织培养即可获得转化的再生植株。世界上已有的转基因植物，大多数是通过农杆菌介导法得到的。

生存形状

根癌农杆菌生活在土壤，特别是耕种过的田地里，因为经过耕种的土壤疏松，适宜根癌农杆菌生长。根癌农杆菌的菌体为棒状，有两三个微米长，靠几根鞭毛运动，鞭毛一般生在侧边。用显微镜放大到1000倍时，人们就能把它看得很清楚了。

在许多双子叶植物靠近地面的根茎交界处，根癌农杆菌能诱发一种帽状肿瘤，人们称之为冠瘿瘤病。这种病曾在法国、东欧和澳大利亚的葡萄等果树上大面积发生，造成很大的危害。在其他地方，甚至城市园林绿化中，也有不少植物患上此病。

人们发现，根癌农杆菌所产生的冠瘿瘤病，与豆科植物根部的固氮根瘤细菌所产生的根瘤相似；然而，事实上，两者的作用方式并不一样。

豆科植物的固氮根瘤菌会钻到植物细胞内部，与植物细胞共生，农杆菌却不于植物共生，根瘤细菌为豆科植物提供氮肥，（农杆菌多在双子叶植物中）植物细胞则供给根瘤细胞其他各种营养。

侵染植物

根癌农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根癌农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根癌农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根癌农杆菌侵染的原因。还发现一些中性糖，如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上 Vir区（毒性区）基因的诱导物，使Vir区基因活化，导致T-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。

需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。GV3101、AGL1、LBA440、EHA105等都有不同的特性，利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。

基因工程

如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：

①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；

②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。

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