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分光光度法

对物质进行定性和定量分析的方法

分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析的方法。它具有灵敏度高、操作简便、快速等优点，是生物化学实验中最常用的实验方法。许多物质的测定都采用分光光度法。在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与不同波长相对应的吸收强度。

方法简介
在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与不同波长相对应的吸收强度。如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。它们与比色法一样，都以Lambert-Bee定律为基础。
上述的紫外光区与可见光区是常用的。但分光光度法的应用光区包括紫外光区，可见光区，红外光区。波长范围：
1、200～400nm的紫外光区
2、400～760nm的可见光区
3、2.5～25μm(按波数计为4000cm-1～400cm-1)的红外光区。
基本原理
选择吸收
物质与光作用，具有选择吸收的特性。有色物质的颜色是该物质与光作用产生的。即有色溶液所呈现的颜色是由于溶液中的物质对光的选择性吸收所致。由于不同的物质其分子结构不同，对不同波长光的吸收能力也不同，因此具有特征结构的结构集团，存在选择吸收特性的最大实收波长，形成最大吸收峰，而产生特有的吸收光谱。即使是相同的物质由于其含量不同，对光的吸收程度也不同。利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质的存在（定性分析），或利用物质对一定波长光的吸收程度来测定物质含量（定量分析）的方法，称为分光光度法。
定量依据
朗伯一比尔（Lambert - Beer）定律是分光光度法定量分析依据的基本原理。当一束单色光（指路由一种颜色的光）通过一均匀的溶液时，一部分被吸收，一部分透过。设入射光的强度为I0，透射光强度为I，则I/I0为透光度，用T表示。百分透过率为 T% = （I/I0）x100%
研究表明：溶液对光的吸收程度即吸光度（A）（又称消光度E、或光密度D）与透光度（T）呈负对数关系，即：A = - lgT
朗伯定律：有色溶液的吸光程度（A）与其液层厚度（光程）b成正比。当溶液浓度不变时，溶液的液层厚度越大，对光的吸收程度A值越大，则透光度越小。
即：A = ab
比耳定律：有色溶液的吸光程度（A）与其浓度（吸光质点数）C成正比。即当溶液的液层厚度不变时，溶液的浓度越大，对光的吸收程度越大，则透光度越小。
即：A = ac
将以上两式合并可用下式表示：A = -lgT=abc
即 A = abc。
上式为朗伯比尔定律，其意义为：当一束单色光通过一均匀溶液时，溶液对单色光的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。
A =abc 中，吸光系数a，表征吸光物质的 灵敏度。a值越大，灵敏度越高。如果浓度的单位为物质的量浓度（单位为：mol/L），则吸光系数a可以写成ε ，ε称为摩尔吸光系数。
由上式可知，当溶液层厚度b和吸光系数a固定时，吸光度A与溶液的浓度成线性关系。在定量分析时，首先需要测定溶液对不同波长光的吸收情况（吸收光谱），从中确定最大吸收波长 ，然后以此波长 的光为光源（单色光），进行吸光度A的测定，这是朗伯比尔定律用于定量分析的首要条件。
检测仪器
仪器分类
依据光谱区，分光光度计可分为：紫外分光光度计，可见分光光度计（或比色计）、红外分光光度计。如果吸光质点是原子，其仪器称为原子吸收分光光度计。
仪器组成
各种分光光度计的基本组成是：光源系统、分光系统、吸收系统和检测系统。
仪器精度
为保证测量的精密度和准确度，所有仪器应按照国家计量检定规程，定期进行校正检定。
定量方法
利用分光光度法对物质进行定量测定，主要有以下几种方法：
1、标准管法
将待测溶液与已知浓度的标准溶液在相同条件下分别测定A值，然后按下式求得待测溶液中物质的含量。
CT=（AT/AS）*CS
2、标准曲线法
先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，分别测定出它们的A值，以A值为横坐标，浓度为纵坐标，作标准曲线（A~c工作曲线），可以求出标准曲线的回归方程。在测定待测溶液时，操作条件应与制作标准曲线时相同，以待测液的A值从标准曲线上查出（得到）该样品的相应浓度。
3、吸光系数法
当某物质溶液的浓度为1mol/L，厚度为1cm时，溶液对某波长的吸光度称为该物质的摩尔吸光系数，以ε表示。ε值可通过实验测得，也可由手册中查出。例如亚铁氮二杂菲配合物的ε值 等于11000 L/cm·mol
已知某物质ε值，只要测出其A值再根据下式便可求得样品的浓度：c=A/ε。
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