分子发光分析法

用于分析分子发光现象的方法

某些物质的分子吸收一定能量后，电子从基态跃迁到激发态，以光辐射的形式从激发态回到基态，这种现象称为分子发光，在此基础上建立起来的分析方法为分子发光分析法。

化学发光分析

释义

化学发光（Chemiluminescence）又称为冷光（Cold Light），它是在没有任何光、热或电场等激发的情况下，由化学反应而产生的光辐射。生命系统中也有化学发光，称生物发光（Bioluminescence），如萤火虫、某些细菌或真菌、原生动物、蠕虫以及甲壳动物等所发射的光。化学发光分析（Chemiluminescence Analysis）就是利用化学反应所产生的发光现象进行分析的方法。它是近30多年来发展起来的一种新型、高灵敏度的痕量分析方法。在痕量分析、环境科学、生命科学及临床医学上得到愈来愈广泛的应用。

特点

极高的灵敏度

荧光虫素（LH2）（luciferin）、荧光素酶（luciferase）和三磷酸腺苷（ATP）的化学反应可测定2×10-17 mol/L的ATP，可检测出一个细菌中的的ATP含量。

较好的选择性

由于可以利用的化学发光反应较少，而且化学发光的光谱是由受激分子或原子决定的，一般来说也是由化学反应决定的。很少有不同的化学反应产生出同一种发光物质的情况，因此化学发光分析具有较好的选择性。

仪器装置简单

不需要复杂的分光和光强度测量装置，一般只需要干涉滤光片和光电倍增管即可进行光强度的测量。

分析速度快

一次分析在1 min之内就可完成，适宜自动连续测定。

定量线性范围宽

化学发光反应的发光强度和反应物的浓度在几个数量级的范围内成良好的线性关系。

基本原理

化学发光是基于化学反应所提供足够的能量，使其中一种产物的分子的电子被激发成激发态分子，当其返回基态时发射一定波长的光，称为化学发光，表示如下

A + B → C﹡ + D

C﹡→ C + hυ

化学发光包括吸收化学能和发光两个过程。为此，它应具备下述条件：

1化学发光反应必须能提供足够的化学能，以引起电子激发。

2要有有利的化学反应历程，以使所产生的化学能用于不断地产生激发态分子。

3激发态分子能以辐射跃迁的方式返回基态，而不是以热的形式消耗能量。

化学发光反应的化学发光效率ΦCl，取决于生成激发态产物分子的化学激发效率Φr利激发态分子的发光效率Φf这两个因素。化学发光的发光强度ICl以单位时间内发射的光子数来表示，它等于化学发光效率ΦCl与单位时间内起反应的被测物浓度CA的变化（以微分表示）的乘积，通常，在发光分析中，被分析物的浓度与发光试剂相比，要小很多，故发光试剂浓度可认为是一常数，因此发光反应可视为是—级动力学反应，此时反应速率可表示为式中k为反应速率常数。由此可得：在合适的条件下，t时刻的化学发光强度与该时刻的分析物浓度成正比，可以用于定量分析，也可以利用总发光强度S与被分析浓度的关系进行定量分析，此时，将式（5-7）积分，得到如果取t1=0，t2为反应结束时的时间，则得到整个反应产生的总发光强度与分析物的浓度呈线性关系。

荧光和磷光

激发过程

荧光和磷光的产生涉及光子的吸收和再发射两个过程。

分子吸收辐射使电子能级从基态跃迁到激发态能级，同时伴随着振动能级和转动能级的跃迁。在分子能级跃迁的过程中，电子的自旋状态也可能发生改变。应用于分析化学中的荧光和磷光物质几乎都含有π→π*跃迁的吸收过程，它们部含有偶数电子。根据泡里不相容原理，在同一轨道上的两个电子的自旋方向要彼此相反，即基态分子的电子是自旋成对的，净自旋为零，这种电子都配对的分子电子能态称为单重态（singlet state），具有抗磁性。当分子吸收能量后，在跃迁过程中不发生电子自旋方向的变化，这时分子处于激发的单重态；如果在跃迁过程中还伴随着电子自旋方向的改变，这时分子便有两个自旋不配对的电子，分子处于激发三重态（triplet state），具有顺磁性。

发射过程

处于激发态的分子是不稳定的，通常以辐射跃迁或无辐射跃迁方式返回到基态，这就是激发态分子的失活（deactivation）。辐射跃迁的去活化过程，发生光子的发射，即产生荧光和磷光；无辐射跃迁的去活化过程则是以热的形式失去其多余的能量，它包括振动弛豫、内转换、系间跨越及外转换等过程。如图3-2所示，S0、S1、S2分别表示分子的基态、第一和第二激发单重态；T1，T2分别表示第一和第二激发三重态。

（1）振动弛豫（Vibration Relaxation，VR）。即由于分子间的碰撞，振动激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转移至较低振动能级的无辐射跃迁过程。发生振动弛豫的时间约为10-12 s数量级。

（2）内转换（Internal Conversion，IC）。指在相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级转移至低能级的无辐射跃迁过程。当两个电子能级非常靠近以致其能级有重叠时，内转换很容易发生。两个激发单重态或两个激发三重态之间能量差较小，并且它们的振动能级有重叠，显然这两种能态之间易发生内转换。

（3）荧光发射。激发态分子经过振动驰豫降到激发单重态的最低振动能级后，如果是以发射光量子跃迁到基态的各个不同振动能级，又经振动驰豫回到最低基态时就发射荧光。从荧光发射过程明显地看到：荧光是从激发单重态的最低振动能级开始发射，与分子被激发至哪一个能级无关；荧光发射前后都有振动驰豫过程。因此荧光发射的能量比分子所吸收的辐射能量低，所以对于溶液中分子的荧光光谱的波长与它的吸收光谱波长比较，荧光的波长要长一些（Stock位移）。

（4）系间跨越（Intersystem Crossing，ISC）是指不同多重态间的无辐射跃迁，同时伴随着受激电子自旋状念的改变，如S1→T1。在含有重原子（如溴或碘）的分子中，系间跨越最常见。这是因为在原子序数较高的原子中，电子的自旋和轨道运动间的相互作用变大，原子核附近产生了强的磁场，有利于电子自旋的改变。所以含重原子的化合物的荧光很弱或不能发生荧光。

（5）外转换（External Conversion，EC）是指激发分子通过与溶剂或其他溶质分子间的相互作用使能量转换，而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程。这一现象又称为“熄灭”或“猝灭”。

（6）磷光发射。第一激发单重态的分子，有可能通过系间跨越到达第一电子激发三重态，再通过振动驰豫转至该激发三重态的最低振动能级，再以无辐射形式失去能量跃迁回基态而发射磷光。激发三重态的平均寿命为10-4～10 s，因此，磷光在光照停止后仍可维持一段时间。

反应的类型

气相化学发光

主要有O3，NO和SO2，S，CO的化学发光反应，应用于检测空气中的O3，NO，NO2，H2S，SO2和CO2等。

火焰化学发光也属于气相化学发光范畴。在300～400 ℃的火焰中，热辐射是很小的，某些物质可以从火焰的化学反应中吸收化学能而被激发，从而产生火焰化学发光。火焰化学发光现象多用于硫、磷、氮和卤素的测定。

液相化学发光

液相化学发光反应在痕量分析中十分重要。常用于化学发光分析的发光物质有鲁米诺、光泽精、洛粉碱、没食子酸、过氧草酸盐等，其中鲁米诺是最常用的发光试剂，其化学名称为3-氨基苯二甲酰酸肼，在碱性水溶液、二甲基亚砜或二甲基甲酰胺等极性有机溶剂中能被某些氧化剂氧化，产生最大辐射波长为425 nm（水溶液）或485 nm（二甲基亚砜溶液）的光，化学发光效率为0.01～0.05。

鲁米诺被H2O2氧化的反应速度很慢，但许多金属离子在适当的反应条件下能增大这一发光反应的速度，在一定的浓度范围内，发光强度与金属离子浓度呈良好的线性关系，故可用于痕量金属离子的测定.这些方法的灵敏度都非常高，但由于至少有约30种金属离子回催化或抑制该反应，使方法的选择性不好，限制了在实际工作中的应用。

鲁米诺及其衍生物的发光反应还可以应用于有机物、药物、生物体液中的低含量激素、新陈代谢物的测定（表3-3）。例如机体中的超氧阴离子·O2-，能直接与鲁米诺作用产生化学发光而被检测，灵敏度高，仪器设备简单，便于推广。机体中的超氧化物歧化酶（SOD）能促使·O2-歧化为O2和H2O2，故SOD对·O2-有清除作用，由于SOD的存在，使鲁米诺-·O2-体系的化学发光受到抑制，可间接测定SOD。

激发发射光谱

激发光谱

荧光和磷光均为光致发光现象，所以必须选择合适的激发光波长。激发光谱的测绘方法为：固定荧光的最大发射波长，然后改变激发光的波长。根据所测得的荧光（或磷光）强度与激发光波长的关系作图，得到激发光谱曲线，见图3-3A。激发光谱曲线上的最大荧光（或磷光）强度所对应的波长，称为最大激发波长，用λex表示。它表示在此波长处，分子吸收的能量最大，处于激发态分子的数目最多，因而能产生最强的荧光。

发射光谱

又称荧光（或磷光）光谱。选择最大激发波长作为激发光波长，然后测定不同发射波长时所发射的荧光或磷光强度，得到荧光或磷光光谱曲线，见图3-3F、P。其最大荧光或磷光强度处所对应的波长称为最大发射波长，用λem表示。

溶液荧光光谱通常有以下几个特征：

（1）Stokes位移。在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光的波长总是大于激发光的波长，即λem＞λex。这主要是由于发射荧光之前的振动驰豫和内转换过程损失了一定的能量，这是产生Stokes位移的主要原因。

（2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关。由于荧光发射发生于第一电子激发态的最低振动能级，而与荧光体被激发至哪一个电子态无关，所以荧光光谱的形状通常与激发波长无关。

（3）与激发光谱大致成镜像对称关系。一般情况下，基态和第一电子激发单重态中振动能级的分布情况是相似的，所以荧光光谱同激发光谱的第一谱带大致成镜像对称。

测量仪器

气相化学发光反应主要用于某些气体的检测，已有各种专用的监测仪，本书不予讨论，下面主要讨论液相化学发光反应的检测。

在液相化学发光分析中，当试样与有关试剂混合后，化学发光反应立即发生，且发光信号瞬间即消失。因此，如果不在混合过程中立即测定，就会造成光信号的损失。由于化学发光反应的这一特点，样品与试剂混合方式的重复性就成为影响分析结果精密度的主要因素。按照进样方式，可将发光分析仪分为分离取样式和流动注射式两类。

分离取样式

分离式化学发光仪是一种在静态下测量化学发光信号的装置。它利用移液管或注射器将试剂与样品加入反应室中，靠搅动或注射时的冲击作用使其混合均匀，然后根据发光峰面积的积分值或峰高进行定量测定。

分离取样式仪器具有设备简单、造价低、体积小和灵敏等优点，还可记录化学发光反应的全过程，故特别适用于反应动力学研究。但这类仪器存在两个严重缺点：一是手工加样速度较慢，不利于分析过程的自动化，且每次测试完毕后，要排除池中废液并仔细清洗反应池，否则产生记忆效应；另一点是加样的重复性不好控制，从而影响测试结果的精密度。

流动注射式

流动注射式是流动注射分析在化学发光分析中的一个应用。光度法、化学发光法、原子吸收光度法和电化学法的许多间隙操作式的方法，都可以在流动注射分析中得到快速、准确而自动地进行。流动注射分析是基于把一定体积的液体试样注射到一个运动着的、无空气间隔的、由适当液体组成的连续载流中，被注入的试样形成一个带，然后被载流带到检测器中，再连续地记录其光强、吸光度、电极电位等物理参数。在化学发光分析中，被检测的光信号只是整个发光动力学曲线的一部分，以峰高来进行定量分析。

在发光分析中，要根据不同的反应速度，选择试样准确进到检测器的时间，以使发光峰值的出现时间与混合组分进入检测器的时间恰好吻合。用流动注射式进行化学发光分析，得到了比分离式发光分析法更高的灵敏度与更好的精密度。

影响因素

荧光量子产率又称荧光效率，物质分子吸收辐射后，能否发生荧光取决于分子的结构。荧光强度的大小不但与物质的分子结构有关，也与环境因素有关。　它表示物质发射荧光的能力，Φ越大，发射的荧光越强。由前面已经提到的荧光产生的过程中可以明显地看出，物质分子的荧光产率必然由激发态分子之活化过程的各个相对速率决定。若用数学式来表达这些关系，得到式中：kf为荧光发射的速率常数，∑ki为其他无辐射跃迁速率常数的总和。显然，凡是能使kf升高而其他ki值降低的因素都可使荧光增强；反之，荧光就减弱。kf的大小主要取决于化学结构；其他ki值则强烈地受环境的影响，也轻微地受化学结构的影响。

荧光与分子结构

（1）跃迁类型。实验证明，π→π*跃迁是产生荧光的主要跃迁类型，所以绝大多数能产生荧光的物质都含有芳香环或杂环。

（2）共轭效应。增加体系的共轭度，荧光效率一般也将增大，并使荧光波长向长波方向移动。共轭效应使荧光增强的原因，主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光系数，π电子更容易被激发，产生更多的激发态分子，使荧光增强。

（3）刚性平面结构。荧光效率高的物质，其分子多是平面构型，且具有一定的刚性。例如荧光素和酚酞结构十分相似，荧光素呈平面构型，是强荧光物质，而酚酞没有氧桥，其分于不易保持平面，不是荧光物质。又如芴和联苯，芴在强碱溶液中的荧光效率接近1，而联苯仅为0.20，这主要是由于芴中引入亚甲基，使芴刚性增强的缘故。再有萘和维生素A都有5个共轭双键，萘是平面刚性结构，维生素A为非刚性结构，因而萘的荧光强度是维生素A的5倍。

一般说来，分子结构刚性增强，共平面性增加，荧光增强。这主要是由于增加了π电子的共轭度，同时减少了分子的内转换和系间跨越过程以及分子内部的振动等非辐射跃迁的能量损失，增强了荧光效率。

（4）取代基效应。芳烃和杂环化合物的荧光光谱和荧光强度常随取代基而改变。表3-1列出了部分基团对苯的荧光效率和荧光波长的影响。一般说来，给电子取代基如-OH，-NH2，-OR，-NR2等能增强荧光；这是由于产生了p-π共轭作用，增强了π电子的共轭程度，导致荧光增强，荧光波长红移。而吸电子取代基如-NO2，-COOH，-C=O，卤素离子等使荧光减弱。这类取代基也都含有π电子，然而其π电子的电子云不与芳环上π电子共平面，不能扩大π电子共轭程度，反而使S1→T1系间跨越增强，导致荧光减弱，磷光增强。例如苯胺和苯酚的荧光较苯强，而硝基苯则为非荧光物质。卤素取代基随卤素相对原子质量的增加，其荧光效率下降，磷光增强。这是由于在卤素重原子中能级交叉现象比较严重，使分子中电子自旋轨道耦合作用加强，使S1→T1系间跨越明显增强的缘故，称为重原子效应。

环境影响

（1）溶剂的影响。一般地讲，许多共轭芳香族化合物的荧光强度随溶剂极性的增加而增强，且发射峰向长波方向移动。如图3-4所示，8-羟基喹啉在四氯化碳、氯仿、丙酮和乙腈四种不同极性溶剂中的荧光光谱。这是由于n→π*跃迁的能量在极性溶剂中增大，而π→π*跃迁的能量降低，从而导致荧光增强，荧光峰红移。在含有重原子的溶剂如碘乙烷和四氯化碳中，与将这些成分引入荧光物质中所产生的效应相似，导致荧光减弱，磷光增强。

（2）温度的影响。温度对于溶液的荧光强度有着显著的影响。通常，随着温度的降低，荧光物质溶液的荧光量子产率和荧光强度将增大。如荧光索钠的乙醇溶液，在0℃以下温度每降低10℃，荧光量子产率约增加3%，冷却至-80℃时，荧光量子产率接近100%。

（3）pH的影响。假如荧光物质是一种弱酸或弱碱，溶液的pH值改变将对荧光强度产生很大的影响。大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧光光谱，对于溶剂的pH和氢键能力是非常敏感的。表3-1中苯酚和苯胺的数据也说明了这种效应。其主要原因是体系的pH值变化影响了荧光基团的电荷状态。当pH改变时，配位比也可能改变，从而影响金属离子-有机配位体荧光配合物的荧光发射。因此，在荧光分析中要注意控制溶液的pH。

（4）荧光的熄灭。它是指荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低的现象。这些引起荧光强度降低的物质称为熄灭剂。

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