分子遗传标记

生物学概念

分子遗传标记是以物种突变造成DNA片段长度多态性为基础的，具有许多优点；（1）直接探测DNA水平的差异，不受时、空的限制；（2）标记数量丰富、多态性高；（3）共显性标识，可以区分纯合子与杂合子；（4）可以解释家系内某些个体的遗传变异；（5）可以鉴定不同性别、不同年龄的个体。随着基因工程特别是DNA重组技术的发展，人们已确知动物不但有毛色、体态、血型、染色体等的多态性，而且有DNA水平的多态性，特别是20世纪80年代以后，研究DNA多态性的各种遗传标记方法发展极其迅速，分子遗传标记应用于动物育种成为现实。

类型

应用较广泛的分子遗传标记有：限制性片段长度多态分析技术(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、DNA指纹分析技术(DNA Fingerprint)、随机引物扩增多态性DNA技术(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD)、STR(Short Tandem Repeats)和扩增片段长度多态性分析技术 (Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)。

RFLP分析技术

RFLP全称为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism），是第一代DNA标记。20世纪70年代中期，遗传学家发现了RFLP现象;1980年Botstein首先提出利用RFLP作遗传标记构建遗传图谱，直到1987年Donis等人才构建出第一张人的RFLP图谱。RFLP基本原理是基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生大小不等的DNA片段;它所代表的是基因组DNA酶切后产生的片段在长度上的差异，这种差异是由于突变增加或减少了某些内切酶位点造成的。RFLP作为遗传标记具有其独特性:（1）标记的等位基因间是共显性的，不受杂交方式制约，即与显隐性基因无关;（2）检测结果不受环境因素影响;（3）标记的非等位基因之间无基因互作效应，即标记之间无干扰。RFLP分析技术的主要缺陷是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难，但随着可标记多态性探针的增多，该技术将在分子生物学研究中得到更广泛的应用。

 其原理为利用限制性内切酶消化基因组DNA，形成大小不等、数量不同的分子片段，经电泳分离，通过Southern印迹将DNA片段转移至支持膜(尼龙膜或硝酸纤维素膜)上，然后用放射性同位素(32P)或非同位素 (如地高辛，荧光素)标记的探针与支持膜上的DNA片段进行杂交。不同基因组DNA酶切位点的改变，会使得RFLP谱带表现出不同程度的多态性.

DNA指纹分析技术

20世纪80年代初期，人类遗传学家相继发现在人类基因组中存在高度变异的重复序列，并命名为小卫星DNA。它以一个基本序列(l1一60碱基对)串连排列，因重复次数不同而表现出长度上的差异。1987年人们利用人工合成的寡核苷酸(2~4碱基对)作探针，探测到高度变异位点，即所谓的微卫星DNA。以小卫星或微卫星DNA作探针，与多种限制性内切酶酶切片段杂交，所得个体特异性的杂交图谱，即为DNA指纹。DNA指纹技术作为一种遗传标记有以下特点:（1）具有高度特异性。同一物种两个随机个体的指纹相似系数仅为0.22，二者指纹完全相同的概率为三千亿分之一;(2)遗传方式简明。DNA指纹遵循孟德尔遗传定律，卫星DNA是高度变异的重复序列，所检测的多态性信息含量较高;（3）具有高效性。同一个卫星DNA探针可同时检测基因组中10个位点的变异，相当于数10个探针。由于卫星DNA不是单拷贝，难于跟踪分离群体中个体基因组中同源区域的分离。

RAPD分析技术

RAPD是Williams等人(1990)发展起来的一种新型遗传标记，尽管这一技术比较年轻，但由于其独特的检测DNA多态性的方式即极快速、简捷、高效等优点，使得RAPD技术已渗透于有关基因研究的各个领域。RAPD是建立于PCR基础之上的，利用随机的脱氧核节酸序列作引物(一般9~10碱基对)，对所研究的基因组DNA体外扩增，扩增产物经电泳分离染色后，来检测其多态性，这些扩增DNA片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD标记特点是：（1）RAPD扩增引物没有物种的限制，一套引物可用于不同物种基因组分析;（2）RAPD扩增引物没有数量上限制，可以囊括基因组中所有位点;（3）RAPD技术简捷方便，可进行大量样品的筛选。RAPD标记是显性的，无法区分动物纯、杂合体，而且在分析中易产生非特异性。

AFLP分析技术

Zabean等(1993)将PCR与RFLP结合起来，创造了AFLP分析技术。基因组DNA先用限制性内切酶双酶切，再在两端连上特定的人工接头，根据接头和酶切位点的序列设计引物。一般在引物的3'端再增加1一3个碱基进行选择性扩增。不同样品由于DNA序列不同，扩增出的片段数及长度各不相同，经变性的聚丙烯酰胺电泳就能区分出不同样品之间的差异，作为遗传标记构建连锁图，或鉴定与特定性状连锁的标记。与RFLP比较，它无需了解DNA模板序列，产生的多态性较多;与RAPD比较，它的可重复性得到极大提高。Higuch从已灭绝的斑驴皮肌中提取DNA，经PCR扩增，进行斑驴与马的亲缘关系研究，取得成功。

应用

基因定位

RAPD快速寻找同一区域连锁DNA标记的方法，可为RFLP连锁间隔区提供新的DNA标记，或增加同一区域分子标记的密度比。由于RAPD能在一次反应中检测基因组的多个位点，因此它可迅速找到两组DNA样品间多态性差异，进而得到与此差异相连锁的DNA标记。RAPD基因定位方法主要有两种：（1）近等位基因系的定位。它是由提供靶基因的供体亲本与轮回亲本杂交、多次回交，通过每代对靶基因选择而获得的、除靶基因外，其它性状大部分与轮回亲本相同的品系；因此，它的基因组DNA除目的基因所在区域与轮回亲本不同外，余者基本相同，这样便为RAPD对两个基因组DNA进行多态性检测提供了可能，找出它们基因组扩增产物的差异，用这些有差异的产物做探针，再由RFLP连锁分析定位这些基因。（2）通过对目的基因有分离的F2进行基因定位。根据F2个体中的目的基因分离构建2个基因文库，然后从中分别随机抽取30个样本，分别提取其DNA，并等量混合，又形成2个新文库，这2个新文库对目的基因是选择性的，而对其它部分基因则是随机的;利用RAPD找出与目的基因区域相连锁的DNA多态性标记，从而定位该基因。

构建基因图谱

基因图谱是遗传学研究的重要内容，也是家畜遗传育种的依据。分子遗传标记构建遗传图谱的原理与形态标记相同，不同的是一个分子遗传标记分离群体，可同时获得几十个乃至几百个标记;而且可以使用不同的分离群体(暂时性或永久性分离群体)。牛、马、猪等家畜的RFLP遗传连锁基因图谱已经构建完成。

背景基因型的选择

Hilel等(1990)认为，在回交群体中，可借助DNA指纹的辅助选择，从而接受或拒绝某一特定的基因组背景，这样有助于基因的导入，但微卫星标记应用于基因导入育种方案，并不具有完美的适应性。Groen等人 (1992)假设被导入基因已被定位，即可在后代中加以鉴定，而实际上是不可能的，而且被导入的QTLs与标记基因常常发生重组现象。Smith等 (1995)在Groen等研究成果的基础上，进一步研究在不同杂交方案中表型选择和标记辅助选择的效率，得出结论，利用标记选择的效果不如表型选择。

杂交选育

根据分子标记位点的杂合性预测各组合之间的杂种优势，可极大地减少配合力测定工作。对杂交后代的鉴定和选择是育种工作的重要内容。在传统育种中，有些性状无法在早期鉴定筛选而被淘汰;如果利用这些性状连锁的分子标记进行辅助选择，不仅可以早期选择，而且能在短时间内对大量后代进行鉴定。大量研究均假设群体处于连锁不平衡状态，并均考虑最简单的情况一一两近交系间的杂交。通过杂种后代(F2)实施标记辅助选择，而后分两个阶段进行:(1)以标识一QTL连锁测验的估计值光标准选用标记，对此，一个重要问题是如何在群体中选择遗传标记，被选标记必须能够解释部分遗传为方差。从基因组所有遗传标记中选择某些较为理想的标记，再从新的独立样本群对标记效应的回归系统进行估计，这种情况下，标记的估计值是无偏的。(2)基于标识基因型和个体表型及其亲属表型进行个体选择。

分子标记为家畜育种开辟了一条新途径，但能否在育种实践中发挥应有的作用，取决于下面4个因素:(1)具有与目标基因紧密连锁的分子标记;(2)具有多态性高的分子标记绘制的遗传图谱;(3)能否实现分子标记分析自动化，降低成本，简化实验;(4)应用标记预测育种值的方法有所改进。这4个方面已取得较大的进展，随着生物技术的深入发展与完善，分子标记在家畜育种中将发挥越来越大的作用。

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