单分子技术

生化技术

生命单元的基本功能主要取决于单个大分子，单分子操纵方法在研究单个生物分子的性质上有着独特的优势。与测量分子集合体整体性质的传统方法(如光散射，光偏振，粘滞性等)相比，单分子技术具有直接，准确，实时等优点。

类别

原子力显微镜技术

原子力显微镜（Atomic Force Microscopy，AFM）是由IBM公司的Binning与斯坦福大学的Quate于1985年发明的，其目的是为了使非导体也可以采用扫描探针显微镜（SPM）进行观测。原子力显微镜通过探针与被测样品之间的微弱的相互作用力( 原子间力) 来获得物质表面的形貌。原子力显微镜将探针装在一弹性微悬臂的一端, 微悬臂的另一端固定, 当探针在样品表面扫描时, 探针与样品表面原子间的排斥力会使得微悬臂轻微变形, 当一束激光经微悬臂的背面反射到光电检测器,可以精确测量微悬臂的微小变形, 这样就实现了通过检测样品与探针之间的原子排斥力来反映样品表面形貌和其他表面结构。

光镊技术

光镊技术( Optical tweezers) 是Ashkin 等在20 年前发明的, 它的原理是利用激光动量转移产生的辐射压力, 从而形成具有梯度力场的光学陷阱, 处在陷阱中的微粒受到梯度力场的作用,就被钳住。这个光学陷阱像是一把小镊子, 因此被称为光镊。如果在小球上连结上生物大分子, 并且把小球钳住在光学陷阱中, 可以在溶液环境中对生物大分子进行操作。光镊是测量和控制生物大分子的有力工具。用这种技术可以测量出生物大分子间微弱的力( 皮牛顿量级) 以及生物大分子的很小位移(纳米量级)。

单分子光谱技术

单分子光谱技术( single-molecule spectroscopy, SMS) 是将荧光基团标记在生物大分子上, 标记在生物大分子上的荧光基团发生各种特性变化, 通过光谱分析等就能够得到有关分子间相互作用、酶活性、反应动力学、构象动力学、分子运动自由度以及在化学和静电环境下活性改变的信息。

应用举例

核酸研究

单分子操作技术已经越来越多地应用到核酸研究当中, 并且取得了重要的进展。这些研究包括: DNA 的打开与修饰、DNA 凝聚、蛋白质-DNA 相互作用、复制和转录等。

核酸单分子操作研究起始于 1992 年 Smith 等对单个 DNA 分子的弹性测量。实验装置如图 1 所示, 一段双链 DNA 分子的一端连接到玻璃表面上, 另一端连接到磁性小球上。DNA 分子连接到不同固体表面是通过生物素-链霉抗生物素蛋白、地高辛免疫的特异反应来实现的, 这类方法至今仍是这个领域的常用方法。整个体系的组装在溶液中完成, 在外加磁力的作用下, DNA 被拉伸, 借助于显微镜, 就能测量到小球的位移。这样, 就可以得到在不同盐浓度缓冲液中的单个 DNA 多聚体( 48502 个碱基对) 的力-延伸曲线, 并且在这个实验中力最大只增加到10 皮牛顿。在作用力很小的体系中, 双链 DNA 的弹性是由熵的竞争所控制, 熵的竞争导致DNA 分子螺旋, 而外部作用力则拉伸 DNA 分子。在力-延伸曲线中可观测到一重要偏离, 而这与高聚物弹性自由连接链模型( the freely jointed chain model ofpolymer elasticity) 预测相一致, 表明DNA 在溶液中有重要的局部弯曲。在蠕虫样链模型( the wormlikechain model) 中, DNA 分子是一个热量变动诱导延伸的弹性管子, 它能提供双链 DNA 在微力作用下弹性变化较好的理论解释。

单分子酶学

与DNA、蛋白质-DNA 相互作用有关的酶学过程也能利用单分子操作技术进行研究, 如用一个解链的实验装置来研究 DNA-蛋白质的相互作用( 实验装置如图2 所示) , 酶结合到双链DNA上可以短暂地阻止 DNA 双链开口叉(the opening fork) 移动。一旦开口叉移动到结合蛋白的位置，力将会增加直到积聚到足够的弹性能量移去蛋白。因此, 蛋白诱导的序列依赖的力信号峰的出现就给出了酶结合到 DNA 上的位置, 而峰值就提供了蛋白质-DNA 复合物稳定性的相关信息。应用这种方法, Bockelmann 等研究了DNA 和EcoRV 限制性内切酶之间的相互作用。Koch 等不仅测量蛋白诱导的力信号峰随不同速度的变化, 而且还比较不同蛋白质-DNA 复合物的稳定性( DNA 与 BsoBI、Xho I、EcoRI 核酸内切酶的相互作用) 。

展望

单分子操作技术具有直接可测性。十年来, 基于核酸单分子操作的研究给我们提供了大量信息, 而这些信息原来是很难甚至不能通过经典的分子生物学方法来得到的。未来的工作包括进一步改进单分子操作的实验技术, 特别是精确度、分子体系控制程度、表面连接方法等。另外, 探索与其它实验技术的联合应用,如对 RecBCD 解螺旋酶解螺旋 DNA 的单分子研究, 研究者们联合使用了微流体技术、光镊技术、单分子荧光技术。另一方面, 实验设计还需要进一步改善, 以利于探索新的发现, 如Michelle 等最近利用单分子荧光光谱技术研究核酶的断裂与连接反应。王鹏业等利用分子梳( molecular combing) 的方法结合单分子荧光光谱技术, 观测到 DNA 的60% 的过度拉伸, 并且观测到了单个 DNA 分子的力诱导熔解现象。单分子操作技术方兴未艾, 把这项技术应用到有创意的实验中去, 有可能带来意想不到的实验结果。

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