单核细胞增生李斯特氏菌

李斯特氏菌科李斯特菌属细菌

单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）简称单增李斯特菌，革兰氏阳性小杆菌，大小为（0.4-0.5）μm×（0.5-2）μm，直或稍弯，多数菌体一端较大，似棒状，常呈V字型排列，有的呈丝状，偶尔可见双球状。在22℃-25℃环境可形成4根鞭毛。本菌对理化因素抵抗力较强。在土壤、粪便、青贮饲料和干草内能长期存活:对碱和盐抵抗力强，对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺等均敏感。

来源

李斯特氏菌是1926年英国南非裔科学家穆里在病死的兔子体内首次发现的。为纪念近代消毒手术之父、英国生理学家约瑟夫·李斯特（1827-1912），1940年，在第三届国际微生物学大会上将其命名为李斯特氏菌。

种类

国际上公认的李斯特菌共有以下七个菌株：单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、绵羊李斯特菌（Listeria iuanuii）、英诺克李斯特菌（Listeria innocua）、威尔斯李斯特菌（Listeria welshimeri）、西尔李斯特菌（Listeria seeligeri）、格雷李斯特菌（Listeria grayi）、默里李斯特菌（Listeria murrayi）。其中，单核细胞增生李斯特氏菌是唯一能够引起人类疾病的，它是一种人畜共患病的病原菌，中毒严重的可引起血液和脑组织感染。单核细胞增生李斯特氏菌简称单增李斯特氏菌，为革兰阳性菌，属厚壁菌门。

细菌分型

根据菌体（O）抗原和鞭毛（H）抗原，将单增李斯特氏菌分成13个血清型，分别是1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e 和“7”13 个血清型。致病菌株的血清型一般为1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、1/2a和4b，后两型尤多。该菌与多种革兰阳性菌有共同抗原，故血清学诊断无意义。

本菌的抗原结构与毒力无关，且本菌与葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌等多数革兰氏阳性菌和大肠杆菌有共同抗原，故血清学诊断无意义。

形态与染色

该菌为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0.5μmх1.0-2.0μm，直或稍弯，两端钝圆，常呈V字型排列，偶有球状、双球状，兼性厌氧、无芽胞，一般不形成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养中的菌体可呈丝状及革兰氏阴性，该菌有4根周毛和1根端毛，但周毛易脱落。

幼龄培养物为革兰氏阳性，陈旧培养物可转为革兰氏阴性，呈两极着色，易误认为双球菌。

培养特性

该菌营养要求不高，在20-25℃培养有动力，穿刺培养2-5天可见倒立伞状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。该菌的生长范围为2-42℃（也有报道在0℃能缓慢生长），最适培养温度为35--37℃，在pH中性至弱碱性（pH9.6）、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在pH3.8-4.4能缓慢生长，在6.5% NaCl 肉汤中生长良好。在固体培养基上，菌落初始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。在5-7%的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的β-溶血环。在0.6%酵母浸膏胰酪大豆琼脂（TSAYE）和改良Mc Bride（MMA）琼脂上，用45角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。

生化反应

该菌触酶阳性，氧化酶阴性，能发酵多种糖类，产酸不产气，如发酵葡萄糖、乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖（迟发酵）、山梨醇、海藻糖、果糖，不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、侧金盏花醇、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖，不利用枸橼酸盐，40%胆汁不溶解，吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性，VP、甲基红试验和精氨酸水解阳性。

抵抗力

该菌对理化因素抵抗力较强，在土壤、粪便、青储饲料和干草内能长期存活，对碱和盐抵抗力强，60-70℃经5-20min可杀死，70%酒精5min、2.5%石炭酸、2.5%氢氧化钠、2.5%福尔马林20min 可杀死此菌。该菌对青霉素、氨苄青霉素、四环素、磺胺均敏感。

分布范围

单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，该菌在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有存在，所以动物很容易食入该菌。

变异性

对于单核细胞增生李斯特氏菌的变异性尚未有确凿证据资料可以证实。

流行病学

单增李斯特氏菌广泛存在于自然界中，不易被冻融，能耐受较高的渗透压，在土壤、地表水、污水、废水、植物、青储饲料、烂菜中均有该菌存在，所以动物很容易食入该菌，并通过口腔-粪便的途径进行传播。据报道，健康人粪便中单增李斯特氏菌的携带率为0.6-16%，有70%的人可短期带菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉制品及15%以上的家禽均被该菌污染。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染，约占85-90%的病例是由被污染的食品引起的。

致病性

单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌，它能引起人、畜的李氏特菌病，感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多症。

单增李斯特菌一般导致肠道感染，通常潜伏期为8～48小时。患者会出现发热、肌肉酸疼、恶心、呕吐等症状，几天即可痊愈。它也能入侵神经系统和循环系统，潜伏长达2～12周，引起严重的脑膜炎和败血症，发病率虽低，病死率却较高。

单增李斯特氏菌进入人体后是否发病，与菌的毒力和宿主的年龄、免疫状态有关，因为该菌是一种细胞内寄生菌，宿主对它的清除主要靠细胞免疫功能。因此，易感者为新生儿、孕妇及40岁以上的成人，此外，酗酒者、免疫系统损伤或缺陷者、接受免疫抑制剂和皮质激素治疗的患者及器官移植者也易被该菌感染。该病的临床表现，健康成人个体出现轻微类似流感症状，新生儿、孕妇、免疫缺陷患者表现为呼吸急促、呕吐、出血性皮疹、化脓性结膜炎、发热、抽搐、昏迷、自然流产、脑膜炎、败血症直至死亡。

该菌可通过眼及破损皮肤、粘膜进入体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿，栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触也是本病传播的可能途径，且有上升趋势。

单核细胞增生李斯特氏菌的毒力因子主要有李斯特溶血毒素、肌动蛋白聚合蛋白、C型磷脂酶、内化素、细胞壁水解酶、酰胺酶以及毒力调节因子等。根据其生物学特性和本中心实验室检测能力范围，实验室可能的感染因子为单核细胞增生李斯特氏菌病原体本身。

单增李斯特氏菌的抗原结构与毒力无关，它的致病性与毒力机理如下：

1、寄生物介导的细胞内增生，使它附着及进入肠细胞与巨噬细胞；

2、抗活化的巨噬细胞，单增李斯特氏菌有细菌性过氧化物歧化酶，使它能抗活化巨噬细胞内的过氧物（为杀菌的毒性游离基团）分解；

3、溶血素，即李氏杆菌素O，可以从培养物上清液中获得，为SH活化的细胞溶素，有α和β两种，为毒力因子。

传播途径

单核细胞增生李斯特氏菌主要以食物为传染媒介，是最致命的食源性病原体之一，造成二至三成的感染者死亡，其致死率甚至高过沙门氏菌及肉毒杆菌。人主要通过食入软奶酪、未充分加热的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、卷心菜色拉、芹菜、西红柿、法式馅饼、冻猪舌等而感染。约80% -90%的病例是由被污染的食品引起的。

该菌可通过眼及破损皮肤、黏膜进人体内而造成感染，孕妇感染后通过胎盘或产道感染胎儿或新生儿。栖居于阴道、子宫颈的该菌也可引起感染。性接触也是本病传播的可能途径，且有上升趋势。

检测方法

1.细菌培养法

该菌营养要求不高，兼性厌氧，最适在含有CO2的微需氧环境中生长，生长温度范围—1.5℃-45℃，最适温度为30℃-37℃，能在普通冰箱冷藏室生长，是一种典型的耐冷性细菌，同时还具有耐盐性。LM在普通琼脂平板上呈细小直径约0.2-0.4μm、半透明露水样菌落。在血琼脂平板上有β溶血环。在显色培养基上呈蓝绿色。

食品中李斯特氏菌的传统检验方法是进行前增菌或选择性增菌，以分离培养得到的可疑菌落做生化反应实验、溶血实验、协同溶血实验（CAM P）等免疫学检测，被确定为李斯特氏菌后进一步进行血清分型。该方法中增菌和选择性增菌是不可缺少的步骤。增菌的方法主要包括：冷增菌法和常温培养方法。冷增菌法是在4℃培养30d ，有时甚至长达一年。常温增菌需培养24h 至7d 。故传统检测方法需要7-11d 才能分离鉴定出李斯特氏菌，故传统方法检测周期较长。

2.血清凝集法

根据菌体抗原和鞭毛抗原，LM分为16个血清型：1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e、5、6a、6b、7。抗原结构与毒力无关，对人致病的主要为血清型1/2a、1/2b、4b，占全球本病病例约90%。

3.分子生物学检测方法

随着核酸探针杂交技术的应用，使对单核细胞增生性李斯特氏菌的检测进入了分子水平。

3 .1 　探针检测技术

这一技术是最早应用于李斯特氏菌检测的分子生物学技术。早在1988年，Atin 等就克隆出李斯特氏菌β溶血素基因的一个500bp DNA 片断并测序，以此序列合成4种寡核苷酸探针，以32P 标记该探针，经斑点杂交实验证实，该探针只与李斯特氏菌反应，与其他种的李斯特氏菌和属外的细菌均呈阴性，表现出很好的特异性。但探针杂交无法分辨死菌和活菌，尽管通过增菌可使死菌比例减少，相对地减少假阳性，但并不能完全杜绝假阳性结果。随着探针技术的逐渐成熟，人们开始关注将多个DNA 特异性探针固定到芯片上，制成基因芯片。基因芯片的特点是可同时检测多种菌，可以减少实验次数，并且检测所需的引物较少。

3.2 聚合酶链式反应（poly merase chain reaction ，PCR）检测技术

PCR 的发展已经相当成熟，广泛应用于李斯特氏菌的检测。PCR 扩增特异性引物一种是依据李斯特氏菌的特异毒力基因序列而设计，一种是依据李斯特氏菌基因组中特异序列而设计。常用的靶序列为hly A 、iap 、inl 、Dth-18等毒力基因。利用PCR 方法来检测李斯特氏菌的优点是方法的特异性好，不足之处是灵敏度较低；将样品培养物经化学抽提后再进行扩增，提高了样品的检出率；并且可以检测到传统增菌方法不能检出的“活的非可培养”的李斯特氏菌。PCR 技术还可对李斯特氏菌进行定量检测。例如Nogva 等运用5′-核酸酶PCR 对单增李斯特氏菌定量；Choia 等运用cPCR 对李斯特氏菌进行定量；Long 等以hly 为靶基因，采用PCRELISA联合检测技术。。

防治方案

预防

单核细胞增生李斯特氏菌在一般热加工处理中能存活，热处理已杀灭了竞争性细菌群，使单增李斯特氏菌在没有竞争的环境条件下易于存活，所以在食品加工中，中心温度必须达到70℃持续2min以上。单核细胞增生李斯特氏菌在自然界中广泛存在，所以即使产品已经过热加工处理后充分灭活了单增李斯特氏菌，但有可能造成产品的二次污染，因此，蒸煮后防止二次污染是极为重要的。因为单核细胞增生李斯特氏菌在4℃下仍然能生长繁殖，所以未加热的冰箱食品增加了食物中毒的危险。冰箱食品需加热后再食用。如果是生鱼片之类的海鲜，则专业酒店都会存放于零下40℃左右的大型冰柜，以确保杀灭寄生虫及防止病菌感染。

治疗

单核细胞增生李斯特氏菌感染治疗可用青霉素、氨苄西林、庆大霉素，红霉素等。对青霉素过敏的可用红霉素和其他广谱抗生素。

风险控制措施

①单核细胞增生李斯特氏菌分离纯化及保菌操作应在生物安全柜内进行，若发生磁珠管破损、磁珠掉落时，应立刻对所涉及的器物进行消毒处理，并按《二级生物安全实验室建设与管理》中“意外事故处理办法章节规范”处置。

②单核细胞增生李斯特氏菌标准菌株的使用、保存严格按照《菌（毒）种管理规程》（ XJK/CX37）要求进行操作，严格实行双人双锁保管，严防菌株被恶意使用而造成的生物危害。

③在单核细胞增生李斯特氏菌阳性菌株在上送过程中严格执行B类运输包装（同“样品采集”），携带“可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输许可证”，由专车运送，由专业人员全程护送。

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