单细胞培养

从植物器官、愈伤组织或悬浮培养物中游离出单个细胞

单细胞培养(single cell culture)是指从植物器官、愈伤组织或悬浮培养物中游离出单个细胞，在无菌条件下，进行体外生长、发育的技术。人们分离和培养植物单细胞的设想和实践都比较早，但成功地进行单细胞培养是随着更有效的培养基的发展以及从愈伤组织悬浮培养物分离单细胞的专门技术的建立才实现的。

定义及介绍

高等植物的单细胞在体外特殊条件下通过细胞分裂形成细胞团，进而通过器官或胚胎发生形成完整植株，这是植物组织培养的一大成功之处。同时，由于植物组织培养中细胞之间在遗传、生理生化上所出现的种种变异，因而通过对单细胞培养获得的单细胞无性系，可以用来研究细胞生物学个体再现过程的研究，生产医学、食品等所需要的次生代谢产物，进行突变体诱导及筛选，细胞融合，产生融合杂种，还可以进行基因转导、微注射、载体导入，无论在理论上还是在实践上都具有重大意义。

单细胞分离

从植物器官分离单细胞

分离单细胞的最佳材料是叶组织，因为叶片中的细胞近似于一个同质细胞群体，较适合于特定和调控的大规模细胞培养。用机械法或酶解法可以从这种完整植物体器官(如叶细胞)分离出单细胞。

1 机械法

指通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单细胞。用机械法可大规模地对薄壁组织细胞进行分离。

2 酶解法

指用专一的水解酶(纤维素酶、果胶酶、琼脂酶等)在温和条件下分解胞间层，游离细胞。

从培养组织中分离单细胞

从培养组织中分离单细胞指将愈伤组织反复继代培养，再转移至液体培养基振荡培养。这是获得单细胞使用最广泛的一种方法。将表面消毒后的植物器官新鲜切片放置在培养基(固体)上，培养基含适当比例的生长素和细胞分裂素，以保证组织培养的顺利进行。外植体切口处形成愈伤组织，逐渐生长扩展到外植体组织的整个表面。将愈伤组织从外植体上分离，转移到成分相同的新鲜培养基上，促使愈伤组织生长。在琼脂培养基上反复继代培养，使愈伤组织结构疏松，为建立优质细胞悬浮系打下基础。液体培养基分装在经高压灭菌后的三角瓶或其他培养瓶中，转入未分化和疏松的愈伤组织块。然后，将三角瓶或培养瓶置于台式摇床或适宜设备上，持续振荡培养。振荡培养的培养基对愈伤组织块产生适度的压力，将愈伤组织分离成游离单细胞和小细胞团。此外，加强培养基和培养瓶内空气之问的气体交换，并使培养基中细胞和细胞团分布均匀。

培养方法

平板培养法

将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种于适当厚度的薄层固体培养基上进行培养的方法，称为平板培养。

等量的单细胞培养液与等量熔化(30～50℃)的琼脂培养基(0．6%～1%)混合，迅速铺板于培养皿中，琼脂冷却凝固后，细胞分布均匀地被固定在薄层(厚度大约1mm)培养基中。培养皿用石蜡膜封闭，在25℃黑暗或漫射光照射下培养。培养皿可以在倒置显微镜下观察，用优质记号笔在培养皿外侧标记单细胞的位置，以便跟踪观察这些细胞的生长和再生，确保筛选出纯的单细胞无性系。

看护培养法

有些植物细胞，一旦分离出来，不仅不能分裂、增殖，还可能死亡。看护培养法是用一块愈伤组织来哺育单细胞，使其正常分裂和增殖的培养方法。用微量移液管或小勺，将来自悬浮培养物或愈伤组织的单细胞转移到漂浮的定量滤纸上，滤纸下是旺盛生长的愈伤组织。几天之后，在愈伤组织看护影响下，在一般培养基中沉寂的细胞开始分裂生长。

细胞悬浮培养法

用液体培养基对保持良好的分散状态的单个细胞或小的细胞聚集体于摇床上进行培养的方法，称为细胞悬浮培养法(cell suspension culture)。依据培养目的不同，可分为浅层培养和深层培养。浅层培养是指使培养材料的一部分裸露于液体培养基表面，采用静止培养的方式，适用于各种器官和组织的培养。深层培养是将培养材料没人液体培养基中，同时采用振荡(或旋转)培养的方式，适用于愈伤组织、单细胞的增殖培养和胚状体的培养。其特点为：①能大量提供均匀的植物细胞，即同步分裂的细胞；②细胞增殖速度快，适用于大规模工厂化生产；③需要特殊的设备，如连续培养装置、倒置式显微镜等，成本较高。

微室培养法

人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂、增殖形成细胞团的方法，称为微室培养法，亦称为双层盖玻片法。其操作是将携带1个细胞的1滴培养基置于无菌载玻片上，并用无菌矿物油包围培养基液滴。再分别在培养基液滴的两侧滴1滴矿物油，在每一矿物油滴上放一张盖玻片。然后，把第三张盖玻片放在培养基液滴上，并与其他2张盖玻片相连，在矿物油内形成包含单细胞的无菌微室，矿物油阻止微室中的水分散失，但允许气体交换。将微室载玻片置于培养皿中培养，一旦肉眼可见到细胞团，立即揭开盖玻片，转移到新鲜液体培养基或半固体培养基上继代培养。微室培养法的特点是：①能够在显微镜下追踪观察单细胞分裂增殖形成细胞团的全过程；②培养基少，营养和水分难以保持，pH值变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。

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