去磷酸化作用

将磷酸基团加在中间代谢产物上

去磷酸化作用是指将磷酸基团加在中间代谢产物上，用于探讨阿尔茨海默病(AD)脑损伤逆转的可能性及其途径。

课题

探讨阿尔茨海默病(AD)脑损伤逆转的可能性及其途径。

方法

用去磷酸化和免疫印迹法研究AD脑损伤可逆性。

原理

蛋白磷酸酯酶(PP)-2A和PP-2B可使AD神经原纤维缠结中的II型双螺旋丝（PHFII-tau）在Ser-199/Ser-202去磷酸化，Ser-396/Ser-404部分去磷酸化;此外，PP-2A和PP-2B可分别使PHFII-tau的Ser-46和Ser-235去磷酸化;去磷酸化后PHFII-tau的相对电泳迁移率加快。Mn2+和Mg2+可增加上述酶对PHFII-tau的去磷酸化作用。酶的去磷酸化作用具有浓度依赖性，随着酶浓度的增加，去磷酸化作用增强。

结论

因为tau蛋白异常过度磷酸化并形成PHF被认为是AD神经原纤维退化的基础，PHF可在体外被蛋白磷酸酯酶去磷酸化的结果提示，AD脑损伤可能是可逆的。

阿尔茨海默(AD)脑中有三种tau蛋白：(1)易溶型非异常磷酸化的tau(C-tau)；(2)易溶型异常磷酸化的tau(ADp-tau)；(3)以双螺旋丝聚集的tau(PHF-tau)。根据PHF-tau在2%十二烷基硫酸钠(SDS)中的溶解性，又可将其分为PHFI-tau和PHFII-tau[1]。与ADp-tau和PHFI-tau不同，PHFII-tau还被部分泛素化修饰[2]。

根据Cohen[3]的分类法，大量存在于人脑中的磷酸丝氨酰和磷酸苏氨酰蛋白磷酸酯酶主要包括四种类型:PP-1，PP-2A，PP-2B和PP-2C。从过去的研究中发现，PP-2C不使所研究的ADp-tau任何位点发生去磷酸化作用，而PP-1仅对少数位点起反应[4]。推测PP-2A和PP-2B可能在AD脑中tau异常磷酸化过程中起关键作用，所以二者均被选用于本研究。

对象和方法

一、组织和抗体来源

该研究中的AD及年龄、性别匹配对照者的脑组织来源于死后6小时内的尸体解剖(各取6例混合后制备匀浆)，AD确诊基于尸检组织切片的病理学检查，人脑组织均贮于-75℃直至使用。牛脑PP-2A和PP-2B的分离纯化分别参照Cohen等[5]和Sharma等[6]的方法。多克隆抗体92e和102C由Iqbal小组制备。单克隆抗体tau-1和PHF-1分别由Binder和Greenberg提供。单克隆抗体SMI-31，SMI-33和SMI-34从Sternberg单克隆公司购买。碱性磷酸酶标记的抗鼠和抗兔IgG从Sigma公司购买。

二、tau蛋白样品的制备

PHFII-tau蛋白制备参照Iqbal等[7]的长程序从AD患者脑中制备。其简要步骤如下:将AD大脑皮质去脑膜及白质后制备匀浆，再用不同孔径尼龙膜进行筛分，在2%SDS溶液中加热和超声破碎，不连续蔗糖密度梯度离心和玻璃珠层析。ADP-tau的制备参阅Kopke等[1]法。

三、去磷酸化反应

除特别标明外，去磷酸化反应均在37℃进行45分钟。反应混合液中含50mmol/LTris-HCl(pH7.0)，20mmol/Lβ-巯基乙醇，0.1g/L牛血清白蛋白，1.0mmol/LMnCl2;各0.01g/L抑肽酶(aprotinin)，Leupeptin和胃酶抑素(pepstatin)，0.07g/LPHF-Ⅱ-tau，2U/mlPP-2A或5U/mlPP-2B(1单位PP-2A或PP-2B分别指在30℃，每分钟催化磷酸化酶a或磷酸化酶激酶释放1.0nmol磷酸的酶量)。在用PP-2B进行的去磷酸化反应液中，还含有1mmol/LCaCl2和1μmol/L钙调素。ADP-tau的去磷酸化反应条件除用较低的磷酸酶浓度外[8，9]，其余同PHFII-tau的去磷酸化条件。去磷酸化位点的检测用免疫印迹法。

四、免疫印迹法

经去磷酸化处理的样品先用4倍体积预冷丙酮进行沉淀，再溶于SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)样品缓冲液，煮沸5分钟后进行5%～15%SDS-PAGE。所用一级抗体的稀释倍数及特性见附表。印迹样品用碱性磷酸酶标记的抗鼠或抗兔IgG作为第二抗体，以5-溴-4-氯-3吲哚磷酸-对氨基甲苯盐(BCIP)和对硝基蓝四唑氯(NBT)作为底物进行显色分析。

结果

一、PP-2A和PP-2B可在多部位使PHFII-tau去磷酸化

PP-2A(2U/ml)和PP-2B(5U/ml)可使PHFII-tau的tau-1表位显色，PP-2A和PP-2B还分别使PHFII-tau的Ser-46和Ser-235去磷酸化。两种酶均使

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