反相色谱法

反相色谱法（英语：Reversed-phase chromatography，RPC）反相色谱法(IGC)一反普通气相色谱的测定方式。以被测的高分子为固定相、以惰性气体为流动相，为了测定需要，在流动相中加入一些探针分子，它们是挥发性的低分子。将探针分子注入气化室气化后，由载气带入色谱柱，测定它们在两相中的分配，从而研究高分产的各种性质，高分子与探针分子的相互作用以及高分子与高分子间的相互作用。

色谱法简介

“反相”这个词有着其历史背景。在1970年代，大多数液相色谱是在未修饰的氧化硅或氧化铝上完成的，他们表面的化学性质是亲水性的，对于极性化合物具有更强的亲和力，因此也叫做“正相”（正常）色谱。若采用烷基链共价键合到支持表面上，则会倒换洗脱顺序。在反相色谱法中，极性化合物先被洗脱出来，而非极性化合物被保持住，因为它们亲和于反相表面。在其他色谱方法中所使用的所有数学与试验研究在反相色谱中亦适用（例如色谱分辨率与柱长成正比）。反相柱色谱法在分析型液相色谱中占绝大多数比例。

在普通气相色谱中，固定相是巳知的，被测的样品在流动相里。由载气带入色谱柱进行分离。反相色谱法(IGC)却一反普通气相色谱的测定方式。以被测的高分子为固定相、以惰性气体为流动相，为了测定需要，在流动相中加入一些探针分子，它们是挥发性的低分子。将探针分子注入气化室气化后，由载气带入色谱柱，测定它们在两相中的分配，从而研究高分产的各种性质，高分子与探针分子的相互作用以及高分子与高分子间的相互作用。

分离机理

在反相色谱法中的固定相是被共价结合到硅胶载体上的直链饱和烷烃，其链的长短不同，最长的是十八烷基、这也是使用得最多的固定相、流动相的极性比固定相的极性强。在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出、极性小的组分后流出。一般说来，固定相上的烷基配合基或被分离分子中非极性部分的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，保留值越大。

固定相

对于生物高分子(例如生物工程产物)的反相色谱分离、特别是对多肽药物的分离纯化，需要尽可能高的分离效率，因此尽可能地选择球形、全多孔，且孔径为25um以上的硅胺键合固定相。单层键合固定相利于传质但稳定性稍差，而多层板合固定相传质虽稍差但稳定性好。对分子量较小者，可选用ODS型配基，而分子量较大者以配基较短者为宜，但链短者稳定性比链长者稍逊。结合无机和有机基质优点的聚合物涂层型固定相有着更广泛耐用的pH直范围，这对生物大分子的分离是极其有利的因素。不过聚合物涂层型无论从制造还是从使用方面尚不如键合相成熟。

流动相

作为反相色谱流动相的自机溶剂主要是乙腈、异丙醇四氢呋喃等，乙腈由于黏度低，且和水组成的二元流动相对多肽和蛋白质的溶解度高，因此被广泛应用，在醇类溶剂中，由于甲醇对一些蛋白质的溶解度低，因而使应用受到了限制，乙醇、正丙醇、特别是异丙醇，和水组成的洗脱体系一般可以得到高的蛋白质回收率而被广泛采用。在选择有机溶剂的同时，要充分考虑到反相柱的类型和生物大分子的特性。

影响因素

1、溶质的分子结构（极性）

极性越弱，疏水性越强，k越大，tR也越大。同系物碳数越多，极性越弱，k越大；引入极性取代基，降低疏水性，k值变小。

2、固定相

键合烷基的疏水性随碳链的延长而增加，溶质的k也增大。硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶质的k越大。

3、流动相

极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大；溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂；溶剂比例：水的比例增加，使k增大。

应用示例

近十年来，高效液相色谱在蛋白质分离纯化方面取得了很大的进展，并得到了广泛的应用。HPLC包括排阻色谱、离子交换色谱、亲和色谱以及反相色谱等，几乎已在蛋白质分离中得到应用。这些方法在蛋白质分离中各有其地位，但到目前为止人们普遍认为反相高效液相色谱是分离纯化蛋白质的最有效的方法之一。

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