变性高效液相色谱

杂合双链突变检测技术

变性高效液相色谱（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）是一项在单链构象多态性 (SSCP)和变性梯度凝胶电泳 (DGGE)基础上发展起来的新的杂合双链突变检测技术，可自动检测单碱基替代及小片段核苷酸的插入或缺失。

基本原理

将工作温度 (柱温 )升高使DNA片段开始变性，部分变性的DNA可被较低浓度的乙腈洗脱下来。由于异源双链 (错配的 ) DNA与同源双链DNA的解链特征不同，在相同的部分变性条件下，异源双链因有错配区的存在而更易变性，被色谱柱保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来，从而色谱图表现为双峰或多峰的洗脱曲线。

技术发展

这一技术最先由Oefner于 1 995年建立，全球使用最多也最易操作的是美国transgenomic公司开发的WAVE 核苷酸片段分析系统，它通过一个独特的DNA色谱柱—DNA Sep柱进行核酸片段的分离和分析。

优势

作为近年来才建立并迅速发展的一种新型基因突变筛查技术，它既能够自动化、高通量进行，且除PCR之外，勿需进行PCR引物修饰、购买特殊试剂、检测标记信号或作其它的样品处理。而已有的许多DNA突变分析技术诸如单链构象多态性 (single-strand conformation polymorphism，SSCP) 、变性梯度凝胶电泳法(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)等均不能满足此要求。DHPLC具有高通量检测、自动化程度高、灵敏度和特异性较高、检测DNA片段和长度变动范围广、相对价廉等优点。与传统的SSCP 、DGGE等方法相比，DHPLC有较多的优点。SSCP的结果受血样质量、提取方法等因素的影响，并且需要跑胶、电泳；DGGE则需要标记引物，存在放射性污染，这两种方法都比较费时费力。而DHPLC则高度自动化，可以自动取样，检测每个样品只需要8分钟左右。DHPLC与其他检测DNA突变方法的最大不同在于，它能够纯化DNA片断。当然，只能检测杂合突变是DHPLC的不足之处，但是这可以利用混合的方法（即将纯合突变样品和野生型样品混合）来解决。

方法学比较研究表明，DHPLC敏感性和特异性可达 96%～100 %，明显高于常用的DGGE、CCM、CSGE、SSCP等变异检测技术。只有基于毛细管电泳技术发展起来的荧光单链构像多态性分析(F-SSCP)在敏感性和特异性方面能与DHPLC相媲美。但PCR引物的设计、PCR方法及条件、医学教|育网|收集整理分离温度及分离梯度等关键因素也影响DHPLC检测敏感性。

总体说来，具备以下几大优势：

1.检测的准确性高，对未知突变大于96%，已知突变大于99%。

2.检测灵敏度高，能检测低水平的突变，可靠检测样品中少至5%的基因型。

3.可分析异质性样本，可进行混合样品的分离检测。

4.操作容易，自动化分析。

5.结果重复性高，速度快。

6.样品通量高。

7.消耗品低价性，性价比高。

应用

该技术在基因突变检测、DNA微卫星鉴定、肿瘤杂合性缺失的检测、RT-PCR的竞争性定量、基因作图、细菌鉴定、DNA片段大小测定及寡核苷酸的分析和纯化等许多基因组研究领域中应用广泛，最近已被进一步应用到mRNA的检测，鉴定差异表达的基因。

微生物领域

传统的微生物分析技术主要通过琼脂培养方法对细菌进行计数和鉴定，尤其是对复杂的混合菌群的分析更是如此。这些方法的缺点除了耗时外（12-72小时），许多细菌还需要特殊的培养条件，如需要苛刻培养条件或厌氧条件培养等，据估计，某些样本菌群中（比如环境样本）只有不到10%的细菌能培养成功。由于传统方法的局限性，微生物学家正致力于通过分子遗传方法对不同微生物样本进行鉴定和分析。WAVE微生物分析系统是进行微生物分子分析的理想工具，它不仅可用于细菌的识别鉴定和检测抗药基因突变，还可用于真菌，病毒和寄生虫等研究领域。

WAVE微生物分析系统是培养不依赖的混合微生物样本分析平台，不仅能鉴定常见的微生物，还能鉴定不常见的，苛刻的，和厌氧的细菌。该技术简单、快速、重复性好，样品分析当天就能出结果。系统自动收集各个分离的DNA片段，并自动记录分析数据。自动的片段收集功能为测序提供模板以进一步确认各种微生物。一旦特定样本中各种微生物的峰型得到鉴定，那么样本的峰型谱可用于定性和定量监测样本中各种微生物的动态变化。

在微生物耐药检测中的应用

随着耐药性微生物的大量出现，针对传染性病原体的治疗策略制定和药物研发变得越来越难。抗微生物治疗面临挑战的一个重要原因就是缺乏能够准确识别致病微生物和耐药基因的有效临床手段。近来发展起来的能识别病原体和研究微生物抗药性的分子生物学方法又为抗微生物治疗和药物研发建立了希望。DHPLC技术可以准确地检测耐药性相关基因突变，已广泛应用于微生物耐药基因突变检测，是基础研究和临床快速检测已知和未知致病细菌以及细菌耐药性基因突变的可靠技术。

从异源混合物中检测遗传突变基因对于监测感染过程中病原微生物耐药性的变化至关重要。在没有选择压力的情况下，耐药突变基因的出现频率低于野生型基因。而低频率的突变很难通过测序检测到，通过亚克隆后的测序结果会偏向频率高的突变类型。DHPLC技术能提高检测少数耐药突变的能力，进而促进对耐药病菌引起的传染病的治疗。

在微生物基因分型和鉴定中的应用

许多病菌具有不同的基因型，它们的致病性差异很大，但是它们其它的特性以及遗传基因都非常相似，使得细菌的准确分型面临很大的技术挑战。在一场大范围疫情爆发中，从菌株水平确定病原菌是至关重要的，只有了解了致病菌株才能正确选择抗菌药物，追踪病菌的来源等。DHPLC通过对具有细微差异的DNA序列的分析可以从菌株水平识别病原菌。

从临床治疗的角度来看，准确确定致病微生物的种类具有重要的价值，它可以保证用药的有效性。DHPLC技术能有效的识别病原微生物。利用通用PCR引物从多种细菌的16S核糖体RNA基因中扩增含有高度变异序列的片段。将这些来自不同种类细菌的扩增产物与参照菌株的扩增产物混和后进行DHPLC检测，会产生一个独特的色谱峰图，可以作为鉴定细菌种类的分子指纹。

对混合微生物样品的分离鉴定

在日常的微生物的检测和鉴定工作中，常常是对混合样品中的微生物进行鉴定。比如常见的污染食物的微生物有十几种，对于一个污染的食物样本，我们需要对所有可能污染的病菌进行鉴定，因而需要一种简单，快速，灵敏的检测技术。DHPLC技术在这方面显示了其良好的应用价值。利用DHPLC灵敏检测DNA序列差异的特性结合细菌16s rDNA基因分型的原理，在属和种的水平上进行细菌鉴定，在部分难以鉴定的菌种间，辅以其它细菌DNA靶点进行进一步的分析，不同的细菌显示特异的DHPLC峰型，从而得到分离和鉴定。

检测微生物的广泛应用

DHPLC技术在微生物学研究中的应用并不仅限于细菌相关的工作。它也可被用在真菌，病毒和寄生虫等研究领域，以识别微生物和检测抗药基因突变。使用DHPLC技术检测微生物有三大优点：

1． DHPLC技术可以可靠地从种属和菌株水平识别微生物，弥补传统的表型识别方法的缺陷。

2． DHPLC技术可以高度准确地检测耐药基因突变。

3． DHPLC技术具有从混合微生物群落中识别突变种类的能力。

在微生物方面应用的展望

DHPLC技术检测微生物可广泛应用于下列领域

1、出入境检验检疫。

2、疾病预防控制中心（CDC）。

3、医院临床检验。

4、工业微生物检验，如食品安全检测、药品检验、化妆品检验、饮用水检验、一次性用品检验。

5、环境微生物监测。