嗜冷酶

微生物

生活在寒冷环境中的微生物能够产生嗜冷酶,保证其在低温环境中的生命活力。嗜冷酶在低温或常温条件下具有较高的催化效率,高温时却能快速失活的特性使其能够广泛应用于实际生产生活中。

前言

从1887年Forster发现0℃下生长的微生物以来，嗜冷菌的概念有十几种，其中较为公认的是根据生长温度的不同将嗜冷菌分为专性嗜冷菌和兼性嗜冷菌的概念。专性嗜冷菌是指生长温度不超过20℃的一类微生物，它们的最适生长温度不超过15℃，在0℃及以下可以生长繁殖；而兼性嗜冷菌最高生长温度可以超过20℃，在0-5℃的环境中可以生长。嗜冷菌中产生的很多酶在低温下才显示高效的催化效率，而在高温下很快失活，这类酶称为嗜冷酶。

Ohgiya等人将嗜冷酶分为3类：第一类酶和同类嗜温酶有相似活性但是热稳定性差于嗜温酶；第二类在低温下活性强但是热稳定性更差；第三类是低温下活性强且热稳定性也较强，但大多数嗜冷酶属于第一、二类，第三类极少，投入应用的嗜冷酶主要属于第二类。随着研究的逐渐加深及应用范围的逐步扩大，嗜冷酶越来越多地被用于工业生产中。

特征

嗜冷酶分子结构一般具有如下一些特征:1、与蛋白构象稳定性有关的分子内静电弱相互作用减小；2、蛋白核心区域疏水作用下降；3、溶剂相互作用及表面亲水性升高；4、具有独特性质的环状结构的插入/删除、与二级结构有关的环状结构或转角中脯氨酸的减少；5、蛋白功能域附近甘氨酸的堆积；6、精氨酸含量减少；7、靠近活性位点关键区域氨基酸的取代；8、离子束缚作用( ion binding) 减弱；9、蛋白质折叠。

物质的结构决定其功能与性质,嗜冷酶的耐冷性肯定与结构的变化有内在的联系。

嗜冷酶大部分具有以下酶学特征：1、在低温下具有较高的催化效率。这是嗜冷酶的基本特征。与同类中温酶相比，嗜冷酶在低温下的酶活性要高出数倍甚至十几倍，如在4℃时嗜冷酶比中温酶的转换数(kcat) 高33倍。但是，嗜冷酶对低温的适应还不彻底，这表现在嗜冷酶虽然在低温下具有较高的酶活性，但仍然低于同类中温酶在37℃下的酶活性；2、具有较低的最适催化温度。由于嗜冷酶对热敏感，其最适催化温度一般都比同类中温酶和高温酶明显低；3、具有较高的热敏感性。嗜冷酶只能在相对低的温度下保持高催化效率，温度稍高即很快失活，表现出很高的热敏感性，如海产弧菌细胞中的苹果酸脱氢酶于30℃处理10min 酶活力完全丧失。丙酮酸脱羧酶在35℃处理30min, 酶活力损失90%。嗜冷酶的热变性温度均比同类中温酶低15～20℃。

嗜冷酶的特殊性质使其在工业生产应用中具有一些优势: 低温下催化反应可防止污染( 同源的嗜温酶不活泼)；经过温和的热处理即可使嗜冷酶的活力丧失, 而低温或适温处理不会影响产品的品质等。

嗜冷机制

1993 年, Rentier小组对几种嗜冷性蛋白酶、脂酶和半乳糖苷酶进行了研究, 发现它们含有几个嗜温酶所没有的“额外”氨基酸残基。Feller等人建立的计算机模型也表明,嗜冷蛋白酶含有大量带负电荷的氨基酸残基,特别是天冬氨酸残基；分子表面的四个极性环状结构呈伸展状态；分子内缺少离子间作用与疏水作用。这些结构特征使酶分子呈松散状态, 具有较大的可变性, 从而导致酶的稳定性降低。Gerday对几种嗜冷酶的研究表明,这些酶与嗜温酶相比, 盐桥更少, 疏水基团更少,芳香烃-芳香烃反应更少,这些都增加了酶的柔性。脯氨酸和精氨酸残基也较少。脯氨酸的结构熵比其它氨基酸小, 更易折叠, 需更高的能量才能解开, 可提高酶的热稳定性。高催化效力与更松散而更具柔性的蛋白质结构形成相关联,这种蛋白质结构容许利用更少的能量投入就产生具有催化效能的构象变化,这样,嗜冷酶代谢反应所需的活化自由能与嗜温酶相比具有更低的值。对酶晶体进行化学交联可使嗜冷酶更稳定。主要是因为酶晶体的晶格里,酶蛋白的稳定性接近理论的极限值,蛋白质与蛋白质间由亲水作用和静电张力捆结在一起, 使蛋白质对热和其它变性因素的抗性明显增加,蛋白质的伸展、凝集和裂解作用减少, 而且活性比游离酶高。由于蛋白质动力学研究嗜冷酶适冷机制的常用途径是取代突变，即在酶蛋白的某个位点改变氨基酸种类来改变蛋白质的高级结构, 再筛选出热稳定性增加或下降的突变株。由此可以看出,酶的稳定性、活性及柔性之间有一定关系。

到目前为止,还没有在嗜冷酶中发现一种或几种与耐冷性有关的模式结构,这说明不同的酶以多种不同的结构上的变化、同一种酶以多种变化的总和来维持低温条件下的高催化活性。这些变化包括：酶分子具有更大的柔韧性和较小的功能域：减少了亚基表面之间的相互作用并增加了暴露于溶剂中疏水残基的数量：酶的活性中心更容易接近底物, 且酶与底物的亲合力更大(较低的Km值)等。这些结构特点是嗜冷酶耐受低温的主要机制。

食品应用

2.1 对食品加工的益处

嗜冷酶在较低温度下具有比嗜温酶更强的活性,利用这一特点,众多必须在低温条件下进行的催化反应可以更高效的进行，并避免了一些高温下不必要的化学反应的发生，如在食品工业中保持食品风味要求生产温度不能过高。同时, 较低的催化温度为工业生产应用节约了大量能源。嗜冷酶的应用不但利用其高特异活性,节省酶量,而且也因为它们易失活, 从而使酶作用终止。这样对食物的口感和质量有很好的保持作用, 而不必担心酶持续作用改变食物的结构。在食品加工过程中, 较低的温度可减少其它中温菌的污染, 缩短加工时间, 避免加热系统的热能消耗。冷活性淀粉酶和蛋白酶还可在低温条件下加速原料的粉碎过程。在以上方面来说, 嗜冷酶是嗜温酶的良好替代物。

嗜冷酶在食品工业方面的应用潜力是巨大的，冷活性的蛋白酶、脂酶、果胶酶、纤维素酶等已被用于食品加工过程中，其中脂酶和蛋白酶具有相当大的应用潜力,脂酶可应用于许多方面, 如作为食品的风味改变酶、去污添剂添加物或立体特异性催化剂等；蛋白酶也可被大量应用于食品工业(啤酒的处理, 面包店中的应用, 发酵食品的生产, 奶酪生产中的加速成熟作用等)。

α-淀粉酶是第一个被成功结晶的嗜冷酶，其最适催化温度比中温α-淀粉酶低30℃,在4℃和25℃下, 其催化效率kcat/Km 分别为嗜温酶的6.6、3.7倍。

在乳品工业中所常用的嗜冷酶有脂酶、凝乳酶、过氧化氢酶，脂酶用于乳制品的增香；在乳酪制造业中, 使用嗜冷的凝乳酶,可防止剩余的蛋白质水解。在牛奶冷藏的过程中, 需要加入过氧化氢进行杀菌, 而过剩的过氧化氢可以用耐冷的过氧化氢酶来分解。脂酶还可用于乳制品和黄油的增香、生产类可可脂、提高鱼油中n-3 系多聚不饱和脂肪酸含量等。乳品行业中, 在低温下使用β-半乳糖苷酶来降低牛奶中造成三分之二世界人口严重诱导乳糖不耐症的乳糖含量，同时能缩短水解时间, 还可减少细菌污染的风险。采用嗜冷性微生物蛋白酶在固定化反应器中制作的豆奶凝乳中只产生轻微的凝块。

在肉类加工工业中, 蛋白酶有助于使肉变嫩, 理想的肉类柔嫩酶可在低温条件下作用于结缔组织胶原和弹性硬蛋白, 并可在50 ℃左右失活, 在肉类pH值(pH 4-5)状态下也具有良好的活性。木瓜蛋白酶已经被用于这一方面, 但到目前为止,还没有微生物来源的蛋白酶被利用, 这主要是由于作用于结缔组织的酶活性太低。

在糕点烘烤的过程中, 嗜冷性淀粉酶、蛋白酶和木糖酶能减少生面团发酵时间, 提高生面团和面包心的质量及香味和湿度的保留水平。使用嗜冷酶的优势不仅体现在其高度专一活性方面, 而且也体现在其易失活方面。这阻止了酶的继续反应, 从而避免了面包瓤结构的改变, 因而不至于使面包变得太软或太粘。

果汁行业中, 使用果胶酶有助于在果汁提取过程中降低饮料黏度, 使得产品更加清澄，其他一些嗜冷酶也是嗜温酶的良好替代品, 可应用于葡萄酒、啤酒、白酒等酿造、动物饲养等行业。

在水产行业，Biotec的酶列表中包括虾减性磷酸酯酶、鳕尿嘧啶DNA糖基化酶(DNA glycosylase，一个重组蛋白)、来自北极扇贝的溶解酵素、鳕胃蛋白酶(作用于蛋白质水解、鱼子酱的生产及除鱼鳞)和一种能有效去鱿鱼皮的酶。

低温细菌、酵母真菌及微藻中都积聚有大量富含不饱和脂肪酸的脂质, 其具有降血脂、降糖和防癌等生理功效。嗜冷酶在其他方面的应用研究也在逐步进展中,如膳食不饱和脂肪酸、作为防冻保护剂的抗冻蛋白、食品发酵中的低温酵母等。

2.2 对食品的危害

嗜冷酶对食品产生的危害主要在乳制品方面。

嗜冷菌可以产生脂肪酶、蛋白酶，这些热稳定性胞外降解性酶类在巴氏消毒过程中基本不受影响，这类脂肪酶和蛋白酶甚至经过UHT处理后仍能保持部分活性，导致脂肪酶分解原料奶中的脂肪球，产生游离的短链脂肪酸而使原料奶酸度升高导致腐败，又由于游离脂肪酸增加，将导致乳产品风味变差，如乳酪味、腐烂味、不洁味或酵母味等。蛋白酶可分解原料奶中的蛋白，导致如产品发苦，在水解过程中释放的氨基酸会使褐变反应加剧，分解酪蛋白，引起蛋白胶凝化。

UHT灭菌奶的凝结和苦味均与嗜冷菌产生的蛋白分解酶有关。苦味的产生主要是由蛋白酶水解蛋白质形成一定分子量范围内的肽造成的。此外，脂肪酶分解脂肪形成低分子醛、酮类物质时也有苦味。蛋白质和脂肪水解程度不同，也会使产品产生异味和变粘稠。因此在UHT奶贮存过程中，蛋白酶与脂肪酶对产品的品质影响比较显著。这些由嗜冷菌产生的脂肪酶、蛋白酶不仅还会导致牛奶的物理品质和感官品质下降、货架期缩短，还会造成片式热交换器的淤塞，使清洗困难。

有一些学者认为，在UHT乳贮存期间发生的老化胶凝现象是由乳中残留的蛋白酶活性造成的，其中起主要作用的酶是天然乳蛋白酶（纤维蛋白酶）和微生物蛋白酶。这些高耐热性酶，在UHT 乳贮存中继续发挥水解作用，从而使蛋白质水解。微生物蛋白酶主要水解κ-CN，生成副-κ- CN，从而使κ- CN 失去对蛋白质的稳定作用，使蛋白质聚集，最终由于蛋白质自身的重力作用沉于底部，随着时间的延长逐渐析出乳清，产生凝胶。另外，UHT 乳贮存期间，蛋白酶水解乳中蛋白，释放出一些产生苦味的氨基酸和短肽，会对乳的风味造成不良影响。有研究表明，当牛乳中热稳定性蛋白质量浓度达到1 ng/mL 时，就足以缩短UHT奶的货架期。

开发前景

有关嗜冷酶的研究日益增多，相信随着研究的持续深入以及生物工程技术的充分利用，嗜冷酶在获取途径、活性改造、应用范围方面都会取得突破性进展，嗜冷酶工业应用前景将会更广阔。

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