固定化酶技术

从生物体内提取出来的酶，用人工方法同定在载体上

固定化酶技术是用物理或化学手段．将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，并可回收长时间使用的一种技术。酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。

介绍

固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶，用人工方法同定在载体上。

1916年N elson和GrImn最先发现了酶的固定化现象。科学家们就开始了同定化酶的研究工作。1969年日本一家制药公司第一次将同定化的酰化氨基酸水解酶用于从混合氨基酸中生产L一氮基酸，开辟了固定化酶在工业生产中的新纪元。我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是微生物所和I上海生化所的工作者开始了固定化酶的研究。

传统载体

1、吸附法

吸附法是最简单的同定化方法．包括物理吸附和离子交换吸附。物理吸附法常用的吸附剂有活性炭、硅藻土、多空玻璃等。离子吸附法是酶与载体通过范德华力、离子键和氢键等作用力固定。

2、包埋法

包埋法的基本原理是载体与酶溶液混合后，借助引发剂进行聚合反应，通过物理作用将酶限定在载体的网格中，从而实现酶固定化的方法。

3.载体偶联法

载体偶联法是指酶分子的非必须基团与载体表面的活性功能基团通过形成化学共价健实现不可逆结合的酶固定方法，又称共价结合法。

4、交联法

交联法是利用双功能或多功能交联试剂，在酶分子和交联试剂之间形成共价键的一种酶固定方法。已报道的利用几丁聚糖、壳聚糖等为载体，在戊二醛、乙二醛等多功能试剂交联-半乳糖苷酶、胃蛋白酶、脲酶等多种酶。

新型载体

邱广亮等用磁性聚乙二醇胶体粒子作载体，采用吸附——交联法，制备出具有磁响应性的固定化糖化酶，简称磁性酶(MIE) 一方面由于载体具有两亲性，MIE 可稳定的分散于水相或有机相中，充分的进行酶催化反应；另一方面，由于载体具有磁响应性，MIE 又可借助外部磁场简单地回收，反复使用，大大提高酶的使用效率。

Puleo 等将钛合金表面用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基，然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表面，或者将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理，再用含碳硝化甘油接枝，进而将溶菌酶和骨形态蛋白进行固定，实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化。

无载体

1、交联溶解酶

交联溶解酶(Cross-LinkedQissolued Enzyme，CLEs)是通过交联剂对酶分子直接交联而获得，也是操作最简单的一种方法。

2、交联酶晶体

交联酶晶体(Cross-Linked Enzyme Crystals，CLECs)是近年来发展起来的新型酶晶体催化剂，是酶结晶技术和化学交联技术的结合。

3、交联酶聚合体

交联酶聚合体（Cross-Linked Enzyme Aggregate，CLEAs）酶分子经沉淀形成不溶性酶聚集体再经交联反应形成。

酶的定向

1、共价固定法

选择性地利用酶分子表面远离活性位点的特定稀有基团(如巯基) 进行反应，使该基团与载体上另一基团共价交联来固定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向，以达到控制其空间取向的目的。

2、氨基酸置换法

利用基因定点突变技术在蛋白质分子表面合适位置置换一个氨基酸分子，通过该氨基酸残基特殊的侧链基团控制固定方向。

3、抗体耦联法

大多数抗体具有足够的稳定性承受各种活化与偶联方法。抗体分子中很多可供偶联用的官能团。可以通过赖氨酸的- 氨基或末端氨基、天冬氨酸的- 氨基、谷氨酸的- 氨基或末端羧基进行一般性的偶联。

4、生物素——亲和素亲合法

生物素是存在于所有活细胞内但含量甚微( <0. 0001 %) 的中性小分子辅酶。亲和素是一个含有四个相同亚基的四聚体，每个亚基均含一个生物素结合位点。

5、疏水定向固定法

细胞粘着分子和其他细胞表面分子通常通过疏水作用固定在脂质膜上，磷脂锚定是常选择的方式。接触位点A糖蛋白可通过神经酰胺疏水固定在细胞表面。

应用

固定化酶技术在医药上的应用进展

利用固定化酶制备单一对映体药物

溶胶凝胶固定化酶测定人体血清中的胆固醇

固定化葡萄糖氧化酶进行临床血糖检测

葡聚糖磁性毫微粒固定化L-天冬酰胺酶治疗急性淋巴白血病

固定化黄色短杆菌、大肠杆菌生产苹果酸

固定化基因工程菌CTB2 生产L-苯丙氨酸等。

固定化酶技术在环境工程中的应用进展

酶反应器是同固定化酶制成的，它可以直接或与其他检测器组成酶电极、酶传感器等分析检测系统来实现对环境污染物的监测；

把脱色酶与苯胺降解菌混合固定用来处理染料废水；

造纸厂纸浆漂白中用上木聚糖酶和漆酶可以避免生产过程中产生不容易以生物方法分解的大量氯代有机物质，从而进一步减少这一生产过程中的污染问题。

固定化酶在食品工业中的应用

尹桂山等采用固定化胰酶水解牛乳中的酪蛋白，降低了牛乳中酪蛋白的含量，从而降低了牛乳中酪蛋白与清蛋白的比例，使牛乳更易消化吸收；

采用聚乙烯醇固定化菊粉酶，用其水解菊芋，作为发酵原料生产乙醇，在 28℃，p H 5.2，发酵液糖度为 20%的条件下，保持反应器内发酵液的流动速度为 42 m L/min，得到最大的发酵速率和酒精转化率；

用磁性固定化酶水解甘薯淀粉制备微孔淀粉，探讨不同处理工艺，如固定化酶用量、反应时间、温度、p H 等对微孔淀粉品质的影响，确定了最佳工艺。

前景

目前，固定化酶技术已成为酶工程研究的重点和热点之一。研究探索新的酶固定化技术、提高固定化酶活性收率、延长半衰期、降低成本将成为固定化酶研究领域的主要研究内容。随着固定化酶研究的深入，必将在微生物发酵、酶工程、精细化工、环境保护、制药、生物传感器等领域，尤其是在大规模生物转化、手性化合物的合成以及其他传统酶和蛋白质等方面得到更广泛的应用。

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