图位克隆

生物技术方法

图位克隆，亦称定位克隆。是指基于目标基因紧密连锁的分子标记在染色体上的位置来逐步确定和分离目标基因的技术方法。用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA顺序，也无需预先知道其表达产物的有关信息，但应有以下两方面的基本情况：一是有一个根据目的基因的有无建立起来的遗传分离群体，如F2、DH、BC、RI等。二是开展以下几项工作：①首先找到与目标基因紧密连锁的分子标记。②用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置。③构建含有大插入片段的基因组文库（BAC库或YAC库）。④以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库。⑤用阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群。⑥通过染色体步行、登陆或跳跃获得含有目标基因的大片段克隆。⑦通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆。⑧通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。

概念

图位克隆(Map - based cloning) 又称定位克隆(positional cloning) , 1986 年首先由剑桥大学的Alan coulson 提出[5 ] ,用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的,无需预先知道基因的DNA 顺序,也无需预先知道其表达产物的有关信息,但应有以下两方面的基本情况:一是有一个根据目的基因的有无建立起来的遗传分离群体,如F2、DH、BC、RI 等。二是开展以下几项工作:(1) 首先找到与目标基因紧密连锁的分子标记;(2) 用遗传作图和物理作图将目标基因定位在染色体的特定位置;(3) 构建含有大插入片段的基因组文库(BAC 库或YAC) ;(4) 以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库;(5) 用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群;(6) 通过染色体步行、登陆或跳跃获得含有目标基因的大片段克隆;(7) 通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆;(8) 通过遗传转化和功能互补验证最终确定目标基因的碱基序列。

原理

用该方法分离基因是根据功能基因在基因组中都有相对稳定的基因座，再利用分子标记技术对目的基因进行精确定位的基础上，用与目的基因紧密连锁的分子标记筛选DNA文库，从而构建目的基因区域的物理图谱，再利用此物理图谱通过染色体步移逐步逼近目的基因或通过染色体登陆的方法，最终克隆目的基因并通过遗传转化实验可以研究目的基因的功能。

程序

1、建立目的基因的遗传分离群体

2、找到与目的基因紧密连锁的分子标记

3、用遗传图或物理作图将目的基因定位在染色体特定位置

4、构建含有大插入片段的基因组文库

5、以与目的基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库

6、用阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群

7、通过染色体步移、登陆或跳查，获得含有目标基因的大片段克隆

8、通过亚克隆获得目标的小片段克隆

9、通过遗传转化和功能互补验证，最终确定目标基因的碱基序列。

存在的问题

1、需要有精确的遗传图谱