基因组重排

生物学术语

基因组重排将重组的对象从单个基因扩展到整个基因组，可以在更为广泛的范围内对菌种的目的性状进行优化组合。

原理

1998年Maxygen公司的Stemmer等人提出了一种新的分子育种方法——全基因组重排技术，这种技术是分子定向进化在全基因组水平上的延伸，它将重组的对象从单个基因扩展到整个基因组-，因此可以在更为广泛的范围内对菌种的目的性状进行优化组合。

基因组重排技术主要在传统诱变的基础上与原生质体融合相结合进行随机重组，这将通过多次重组将多个亲本的优良性状集中到同一株品种，而不需要了解整个基因组的序列数据和信息。基因组重排技术虽然起源于原生质体融合，但是与原生质体融合相比，基因组重排技术允许经诱变技术处理产生的多个正突变菌种之间进行重组，并且通过几轮递归基因组融合，导致最终改进的菌株涉及来自多个正突变菌株的遗传性状，极大增加了“复杂后代”的遗传多样性，并显著提高获得高性能菌株的机会。

方法

基因组重排技术大致的过程可分为突变体库的构建、原生质体融合与融合子筛选、递归原生质体融合三个基本环节。

首先需要对常规的菌种进行传统诱变从而建立突变体库，诱变的方式有紫外诱变、X射线诱变、化学诱变剂诱变等，其诱变依然有其不定向性。因此要在此基础上筛选拥有较优良性状的菌株构建突变体库。

接下来是原生质体的融合，融合之前首先需要进行原生质体的制备。微生物原生质体的制备关键是对细胞壁的消化。目前，制备原生质体大都是利用酶解法脱去细胞壁。但由于各种微生物细胞壁组成迥异，制备原生质体的条件也各不相同。比如，在制备细菌、放线菌的原生质体时，主要使用溶菌酶作为工具酶。而对于酵母菌等真菌时，使用酶复合物或商品酶的混合液比单独使用一种酶的效果好。

而原生质体的融合方法主要分为电击融合等物理手段或者PEG诱导的化学手段。电融合是以空间定向，时间同步的可控方式来实现原生质体的融合，其融合频率高，对细胞损伤较小。PEG则是一种表面活性剂，加入后会提高融合频率，但PEG的浓度必须处于一个特定的范围之后，否则会对细胞造成损伤。另外融合时间、融合温度、融合菌株之间的亲和力对融合效率都有影响。在融合结束时将获得的原生质融合体离心，洗涤，重悬于缓冲液中，连续稀释并在再生培养基上再生，获得菌株并进行下一轮融合，重复几轮直至获得所需的菌株。

之后需要进行融合子的筛选，根据筛选目的不同，筛选的方式也各不相同。筛选高产的目的菌株时，主要依靠产物的物理和化学性质，如在琼脂培养基上的抑菌圈、透明圈及水解圈等。筛选对某物质具有抗性的目的菌株时，则可以利用相应的选择培养基。此外还有一种筛选方法是亲本原生质体的灭活，该方法常用的两种灭活标记主要分为单亲灭活标记和双亲灭活标记，如果亲本用一种灭活方式，由于损伤的位点可能相同，所以很难通过融合来再生，如果用两种不同的方式灭活，那么受损的部位不同，这样通过融合修复受损的部位在再生平板上就可以再生，双亲灭活是一种高效可靠的筛选标记，省却了双亲的遗传标记，提高了融合效率。

最后一步即为递归融合，递归融合即从首轮重排的融合子中选出性状得到改进的融合子作为下一轮的亲本，将其制成原生质体再进行融合，重复以上步骤直至得到理想的融合子。

应用优势

微生物是生产氨基酸、抗生素、抗病毒剂和酶制剂等生物制品的重要来源。因此，如何提高微生物的产量或是增加其抗性一直以来是微生物育种的中心话题。Stemmer等在1994年率先提出DNA重排技术，该技术是一种体外定向进化分子的方法，在一定程度上模仿生物体自然进化过程中减数分裂期等位基因间的DNA片段交换。Stemmer等也首次将基因组重排技术应用于弗式链霉菌，研究显示仅通过两轮递推式融合所得到的高产菌株就能优于历经20年经过20轮常规诱变所获得的高产菌株。所以基因组重排技术的优势在于它的快速、高效。

同时，基因组重排产生的子代稳定性更高，安全性也更高，因为这个技术本身模拟了自然进化的过程，降低或消除了有害的突变。也不同于基因工程菌种，不会将外来基因拼接上去，因此产生的菌株也有更高的安全性。

基因组重排技术也无需对菌种的遗传背景十分清晰，不同于DNA重组技术、定向进化工程、代谢工程和系统生物学手段等，使人们有可能直接得到理想中的优良性状，在一定程度上达到了定向进化的目的，但这些技术手段都是建立在对目标菌株遗传背景深入了解的基础上，需要花费较长的时间和精力去研究不同菌株的遗传规律。而基因组重排则无须深入了解微生物具体的调控机制，它以细胞内整套基因组为对象，可进行随机交换重组整合，通过筛选最佳的“组合”，从而加快定向进化的速率，达到快速育种的目的。

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