基因重组疫苗

感染病学名词

基因重组疫苗是用基因重组技术在活载体上插入目的基因所表达的病原微生物特异性抗原制备的疫苗。克服了传统制备方法筛选弱毒菌株或弱毒病毒株困难的缺点。

基因重组

发生在生物体内基因的交换或重新组合。包括同源重组、位点特异重组、转座作用和异常重组四大类。是生物遗传变异的一种机制。

指整段DNA在细胞内或细胞间,甚至在不同物种之间进行交换,并能在新的位置上复制、转录和翻译。在进化、繁殖、病毒感染、基因表达以致癌基因激活等过程中,基因重组都起重要作用。基因重组也归类为自然突变现象。基因工程是在试管内按人为的设计实施基因重组的技术,也称为重组DNA。

有目的的将一个个体细胞内的遗传基因转移到另一个不同性状的个体细胞内DNA分子,使之发生遗传变异的过程。来自供体的目的基因被转入受体细菌后,可进行基因产物的表达,从而获得用一般方法难以获得的产品,如胰岛素、干扰素、乙型肝炎疫苗等是通过以相应基因与大肠杆菌或酵母菌的基因重组而大量生产的。即基因重组

由于基因的独立分配或连锁基因之间的交换而在后代中出现亲代所没有的基因组合。

原核生物的基因重组有转化、转导和接合等方式。受体细胞直接吸收来自供体细胞的DNA片段，并使它整合到自己的基因组中，从而获得供体细胞部分遗传性状的现象，称为转化。通过噬菌体媒介，将供体细胞DNA片段带进受体细胞中，使后者获得前者的部分遗传性状的现象，称为转导。

自然界中转导现象较普遍，可能是低等生物进化过程中产生新的基因组合的一种基本方式。供体菌和受体菌的完整细胞经直接接触而传递大段DNA遗传信息的现象，称为接合。

细菌和放线菌均有接合现象。高等动植物中的基因重组通常在有性生殖过程中进行，即在性细胞成熟时发生减数分裂时同源染色体的部分遗传物质可实现交换，导致基因重组。

基因重组是杂交育种的生物学基础，对生物圈的繁荣昌盛起重要作用，也是基因工程中的关键性内容。

基因工程的特点是基因体外重组，即在离体条件下对DNA分子切割并将其与载体DNA分子连接，得到重组DNA。1977年美国科学家首次用重组的人生长激素释放抑制因子基因生产人生长激素释放抑制因子获得成功。

此后，运用基因重组技术生产医药上重要的药物以及在农牧业育种等领域中取得了很多成果，预计下世纪在生产治疗心血管病、镇痛和清除血栓等药物方面基因重组技术将发挥更大的作用。

从广义上讲,任何造成基因型变化的基因交流过程,都叫做基因重组。而狭义的基因重组仅指涉及DNA分子内断裂—复合的基因交流。真核生物在减数分裂时,通过非同源染色体的自由组合形成各种不同的配子,雌雄配子结合产生基因型各不相同的后代,这种重组过程虽然也导致基因型的变化,但是由于它不涉及DNA分子内的断裂c复合,因此,不包括在狭义的基因重组的范围之内。

根据重组的机制和对蛋白质因子的要求不同,可以将狭义的基因重组分为三种类型,即同源重组、位点特异性重组和异常重组。同源重组的发生依赖于大范围的DNA同源序列的联会,在重组过程中,两条染色体或DNA分子相互交换对等的部分。真核生物的非姊妹染色单体的交换、细菌以及某些低等真核生物的转化、细菌的转导接合、噬菌体的重组等都属于这种类型。大肠杆菌的同源重组需要RecA蛋白,类似的蛋白质也存在于其他细菌中。位点特异性重组发生在两个DNA分子的特异位点上。它的发生依赖于小范围的DNA同源序列的联会,重组也只限于这个小范围。两个DNA分子并不交换对等的部分,有时是一个DNA分子整合到另一个DNA分子中。这种重组不需要RecA蛋白的参与。异常重组发生在顺序不相同的DNA分子间,在形成重组分子时往往依赖于DNA的复制而完成重组过程。例如,在转座过程中,转座因子从染色体的一个区段转移到另一个区段,或从一条染色体转移到另一条染色体。这种类型的重组也不需要RecA蛋白的参与。

基因重组的类型

基因重组是指一个基因的DNA序列是由两个或两个以上的亲本DNA组合起来的。基因重组是遗传的基本现象，病毒、原核生物和真核生物都存在基因重组现象。减数分裂可能发生基因重组。基因重组的特点是双DNA链间进行物质交换。真核生物，重组发生在减数分裂期同源染色体的非姊妹染色单体间，细菌可发生在转化或转导过程中，通常称这类重组为同源重组(homologous recombination)，即只要两条DNA序列相同或接近，重组可在此序列的任何一点发生。然而在原核生物中，有时基因重组依赖于小范围的同源序列的联会，重组只限于该小范围内，只涉及特定位点的同源区，把这类重组称作位点专一性重组(site-specific recombination)，此外还有一种重组方式，完全不依赖于序列间的同源性，使一段DNA序列插入另一段中，在形成重组分子时依赖于DNA复制完成重组，称此类重组为异常重组(illegitimate recombination)，也称复制性重组(replicative recombination)。

噬菌体基因重组

历史：1936年F. M. Burnet发表了噬菌体能产生突变体，其噬菌斑的外形和野生型的有明显区别，可惜的未能引起重视，以致噬菌体遗传学延迟了十年才得以建立。

1946年第11届冷泉港学术讨论会上，在宣布一基因一酶学说的胜利，及Ledernerg、Tatum细菌杂交实验报告的同时，Hershey和Luria宣布发现了噬菌体的r，h突变，Delbrück和Hershey发表了他们各自发现的噬菌体重组，这四项重大的发现分别在1958年和1969年获得了诺贝尔奖。后两项的发现有力地推动了噬菌体遗传学的发展。

噬菌体的基因重组和细菌不同，而和真核的重组十分相似。杂交是用标记不同的噬菌体之间进行。然后计算重组噬菌体占总的子代噬菌体的比例来确定重组值。一般可以选用2－4个基因差异的噬菌体来混合感染细菌。首先把不同类型的噬菌体混合起来和细菌一起涂布在固体培养基上，细菌的浓度要达到可以长成菌苔（lawn）的水平，噬菌体的浓度要很稀。每个噬菌体感染一个细菌，经过裂解周期，宿主细胞破裂后，释放出的子噬菌体又去感染周围的细菌，结果在菌苔上形成一个圆形清亮的斑，称为噬菌斑（plaque），而一个噬菌斑来自最初涂布平板时的一个噬菌体。噬菌斑的形态必须选择容易区别的，以表示噬菌体的相应表型。单个的噬菌体只能在电镜下才可观察其形态，突变引起其形态变化没有电镜是无法鉴别的，但突变影响到生活周期，会产生不同的噬菌斑，因此通过噬菌斑的观察我们很容易观察基因型的变化与重组。

Hershey等用T2噬菌体的两个不同表型特征：噬菌斑的形态和宿主范围来进行杂交。一个噬菌体的基因型是h+r，另一个噬菌体的基因型是h r+。h+表示宿主范围（hostrange），是野生型，能在E.coli B菌株上生长，r 表示快速溶菌（rapid lysis），产生的噬菌斑大，边缘清楚。h噬菌体能在E.coli B和B/2品系上生长，r+产生小而边缘模糊的噬菌斑，能产生透明的噬菌斑，而h+因只能裂解E.coli B，所以在B和B/2的混合菌上产生的噬菌斑是半透明的。

杂交时hr+和h+r混合感染E.coli B和B/2，在B和B/2混合菌苔上出现了四种噬菌斑,表明h r+ 和h+r之间有一部分染色体在B菌株的细胞中进行了重组，释放出的子噬菌体有一部分的基因型为h+r+和h r。我们利用下面的公式就可以计算出和两个位点的重组值：

重组值=（h+r++h r）/总噬菌斑数×100%

此重组值也表示两个连锁基因之间的遗传距离。

重组和突变区别

基因重组是指非等位基因间的重新组合。能产生大量的变异类型，但只产生新的基因型，不产生新的基因。基因重组的细胞学基础是性原细胞的减数分裂第一次分裂，同源染色体彼此分裂的时候，非同源染色体之间的自由组合和同源染色体的染色单体之间的交叉互换。基因重组是杂交育种的理论基础。基因突变是指基因的分子结构的改变，即基因中的脱氧核苷酸的排列顺序发生了改变，从而导致遗传信息的改变。基因突变的频率很低，但能产生新的基因，对生物的进化有重要意义。发生基因突变的原因是 DNA在复制时因受内部因素和外界因素的干扰而发生差错。典型实例是镰刀形细胞贫血症。基因突变是诱变育种的理论基础。

阻击艾滋病

自1985年我国报道了首例HIV感染者以来，HIV感染者人数不断增加，正处在流行快速发展期。卫生部疾病控制司提供的最新报告显示，从1985年到1999年底，全国累计报告艾滋病病毒感染者17316例，其中艾滋病人677例（已死亡356例），报告感染者遍布全国各省，到2000年底前我国艾滋病实际感染人数可能将突破100万，形势十分严峻。

世界各国已有几种药物被批准用于艾滋病临床治疗，但由于价格昂贵（1.3—5.0万美元/人/年治疗费用），全球仅有5%左右的HIV感染者能够获得治疗。另一方面这些艾滋病的药物存在着毒副作用、耐药性等问题，对我国以及发展中国家并不适用。为此，近年来国内外大多数科学家又一次将目光集中于新型艾滋病基因工程重组疫苗的研究和开发，并认为一个安全、有效的疫苗是阻止艾滋病流行的唯一可能途径。

解放军军需大学研究所病毒室、解放军基因工程重点实验室（以下简称军需大学）于1990年跟踪HIV流行的发展趋势，启动了AIDS基因工程重组疫苗研究。军需大学首先利用自己构建的高效痘苗病毒基因重组真核活载体表达系统（该基因重组表达系统具有安全、廉价、易操作、稳定、外源基因容量大、忠实表达各种外源蛋白），进行了HIV—1型和HIV—2型两种国外流行株艾滋病病毒多种完整结构蛋白表达和调控研究，为AIDS疫苗的研究积累了一定数据。在此基础上又进行了HIV—1型和HIV—2型巨分子多种嵌合蛋白的高效表达和小鼠免疫原性实验研究。

近年来的HIV疫苗的实验免疫结果表明，如上所述的基因重组活载体疫苗、DNA疫苗、巨分子病毒样粒子蛋白疫苗和亚单位疫苗等多种不同疫苗联合应用，可有效提高机体的免疫原性。

为制备安全、有效的哺乳动物非复制性基因重组AIDS活载体疫苗，军需大学利用自己构建的鸡痘病毒非复制性重组活载体表达系统（该基因重组表达载体系统更具有安全、有效，在哺乳动物细胞中不复制、不污染环境等优点—已申请专利），进行了艾滋病病毒国外流行株结构基因的表达、基因工程活载体疫苗构建研究。又与预防医学科学院合作，进行了艾滋病病毒中国流行株B亚型和C亚型完整结构基因的表达、基因工程活载体疫苗构建和小鼠免疫原性实验。

DNA疫苗是近年来兴起的一类新型疫苗。军需大学利用DNA疫苗构建系统，进行了HIV—1型中国流行株结构蛋白基因的表达和实验免疫研究，同时又探索了安全的HIV—重组鸡痘病毒活载体重组疫苗和DNA疫苗的小鼠混合实验免疫研究，证明了多种HIV基因重组疫苗联合免疫的可行性。

经过以上近十年的基础研究，逐步完善、提高了AIDS疫苗的上游基础研究水平。正在加快AIDS基因工程疫苗的研究开发力度，使其更接近产业化。

保护效果

据国家“九五”科技攻关项目《乙型肝炎疫苗预防效果和乙型肝炎病毒基因变异的研究》课题报告，研究人员在湖南省湘潭市等4个乙肝疫苗试点区内，对1986~1988年出生并接种乙肝血源疫苗的新生儿，按免疫年龄分层随机抽样采血随访，在15年随访中没有加强免疫的前提下，乙肝疫苗阻断乙肝病毒慢性感染的效果持续在90%左右。

项目组在河北省、广西壮族自治区和湖南省乙肝疫苗试点区，于1996年开始应用基因疫苗替代血源疫苗，并使新生儿基因疫苗接种率持续维持在95%以上。随机抽样2000多名1996年进行基因疫苗接种的新生儿，分别于1997、1998、2000年采血观察基因疫苗免疫后抗-HBs阳转率和近期保护效果。结果显示，国产乙肝基因重组疫苗大规模推广后安全、有效和可行，抗-HBs阳转率和近期保护效果（3年）与血源疫苗相当。单纯乙肝基因疫苗的母婴阻断效果为87.8%，基因疫苗加HBIG阻断病毒感染效果为91.2%。国产基因重组疫苗保护效果可与引进国外技术生产的疫苗效果相媲美。

课题组夏国良研究员特别指出，要提高群体保护效果的关键是提高新生儿免疫接种率和全程接种率的同时，提高母婴阻断效率并尽量在出生后24小时内完成首剂疫苗免疫。

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