复制型

分子结构

复制型指某种核酸处于复制状态的各种分子结构。更多地用于指RNA或单股DNA病毒复制期间形成的双螺旋中间体。与之相联系的主要有复制型DNA，复制型基因克隆，复制型转座等过程，而复制型转座又可分为两种，一种需要RNA作为中间产物，一类不需要RNA作为中间产物。

DNA的复制型

在未受照射的细菌中，复制位点(replicating site)或生长点开始于DNA分子的起始点，并且复制点围绕环形分子半保留地发生复制。照射后，合饼应用溴尿嘧啶标记和氯化铯梯度离心的方法观察到复制型与正常不同。在此方法中，用3H一胸腺嘧啶预先标记大肠杆菌几个世代。预先标记的细胞或受照射或不受照射，然后用14C一溴尿嘧啶进行培养。掺入的14C放射性表现出与新复制的DNA部分有关。将细菌DNA进行氯化铯梯度离心时，3×109道尔顿的DNA分子被分成平均大小为6×106到1.6×107道尔顿的断片，根据浮力密度可分成三种类型的断片。一型是轻的DNA(1.710)由两条无溴尿嘧啶标记的链组成，另一型是混合DNA(1.754)由一条溴尿嘧啶标记的链和一条无溴尿嘧啶标记的链组成，第三型是重DNA(1.800)由两条溴尿嘧啶标记的链组成。

在未受照射的细菌中，14C放射性出现于混合峰的位置，并且在一个世代期间随着时间而增加。以后，在混合峰和重峰两者均可见到14C放射性。这反映了正常细菌的一种半保留线性的复制型。但是，受照射的细菌，在照射后前10分钟14C放射性首先出现于轻峰和混合峰之间的中间区域(即有限的复制)。到20分钟时和以后，14C在混合峰中大量地出现，同时也开始在重峰中出现(即重复复制)，比未受照射细胞在重峰中出现早得多。即使重峰形成时，在照射细菌中仍保留一个轻峰。

受照射细菌的复制型可解释如下。照后即刻短时间内，细菌能使已开始复制的DNA继续进行复制，但不能开始新的复制。将细菌放到缺乏氨基酸的培养基或氯霉素中，可观察到相似的中间峰，这一情况支持了上述设想。在此条件下，蛋白质合成受抑制，而只有已经复制的DNA能继续复制。这与由一个无溴尿嘧啶的链和一个部分有溴尿嘧啶标记及部分无溴尿嘧啶标记混合的链组成的DNA的中间密度也是一致的。此类型的复制称为“有限的复制”。但是，20分钟以后细菌仍可再开始复制。由于蛋白质合成受抑制，可影响DNA合成的开始复制，故新蛋白质的合成，如复制点的蛋白质合成，对DNA复制的开始非常重要。推想DNA复制的启动或生长点是受染色体其它位点的远距离控制。在已复制的DNA部分(混合部分)中已形成复制点时，从这些点复制的一些DNA可包含两条溴尿嘧啶标记的链或重DNA。这称为“重复复制”。在照射时复制点的区域也观察到重复复制。这种障碍可使DNA的某个部分的复制受抑制或延迟，因而造成照射细菌中持续存在一个轻峰。

复制型转座

复制型转座(replicative transposition)是将供体的转座元件复制一份，插入到受体的靶位点。每转座一次，转座元件的拷贝数就增加一个。复制型转座又可分作两类，一类不需要RNA中间物，另一类需要RNA中间物。

不需要RNA中间物的复制型转座

在不需要RNA中间物的复制型转座过程中，转座子一般由Y2一转座酶催化进行滚环复制。使用此途径进行复制的转座子有IS91和Helitron，转座过程一般有两种机制。一种机制的复制和插入分开进行，具体步骤如下：①转座酶切开转座子起点处的一条链，酶的Tyr—OH与切口的5‘—磷酸基以酯键连接，切口的另一侧为游离的3‘—OH。②以3’—OH作为引物，开始链取代合成。③链取代合成达到转座子的终点，转座酶在终点处切开同一条链，游离出单链转座子。④新合成DNA链的3’—OH亲核进攻转座子终点5‘—磷酸基与酪氨酸形成的酯键，形成磷酸二酯键，并释放出转座酶。⑤转座酶在受体分子的靶位点上切开DNA的一条链，酶与5‘—磷酸基形成酯键，并释放出游离的3’—OH。⑥被游离出来的单链转座子用3’—OH亲核进攻靶位点上5‘—磷酸基与酶形成的酯键，同时，受体分子靶位点上的3’—OH也亲核进攻单链转座子上5‘—磷酸基与酶形成的酯键，将单链转座子插入到靶位点。随后，在靶位点的另一条链上进行DNA的修复合成，生成转座子的互补链。

另一种机制的复制与插入是同时进行的，具体步骤如下：①转座子的起点和靶位点同时被转座酶切开，酶的两个酪氨酸一OH分别与两个5‘—磷酸基形成酯键，释放出两个游离的3’—OH。②靶位点上的3’—OH进攻转座子起点上5‘—磷酸基与酪氨酸形成的酯键，形成连接靶位点和转座子起点的磷酸二酯键。③以转座子起点的3’—OH为引物，开始DNA链的取代合成，在供体分子上合成转座子的一条新链。④转座酶在供体分子转座子终点处的剪切，使供体分子单链转座子的3’—OH游离出来，并进攻受体分子上5‘—磷酸基与酪氨酸形成的酯键，使供体分子的单链转座子完全插入到靶位点上。⑤受体分子通过DNA的修复合成，生成转座子的互补链。

上述两种机制的结果是相同的，在转座过程中，转座子复制1次，在供体分子和受体分子上各有一条新合成的链。

需要RNA中间物的复制型转座

逆转录转座子都需要RNA中间物，但LTR逆转录转座子和无LTR逆转录转座子在转座的具体步骤上有很大的差别。

LTR逆转录转座子进行转座时，形成cDNA的过程与逆转录病毒合成cDNA相同，双链cDNA通过剪切一黏接转座插入靶序列。无LTR逆转录转座子的转座过程较复杂，以LINE为例，转座的基本过程如下：①在RNA polⅡ的催化下，由LINE-DNA转录生成LINE-mRNA。②LINE-mRNA进入细胞质，翻译生成逆转录酶和内切核酸酶。③LINE-mRNA与翻译产物一起返回细胞核，结合到受体DNA富含T的靶位点，复合体中的内切核酸酶在靶位点切开DNA的一条链，产生3'—OH和5‘—磷酸基，并形成RNA—DNA杂合分子短片段。④逆转录酶在靶位点的3'—OH上，以LINE-mRNA为模板，启动逆转录，开始合成cDNA的第一条链。⑤靶位点上的第二条链被内切酶或宿主细胞内的核酸酶切开，产生3'—OH和5‘—磷酸基。新合成的cDNA第一条链与靶位点上的另一条链形成双链短片段，以靶位点上的3'—OH为引物，合成cDNA的第二条链。⑥靶位点上的缺口被宿主DNA聚合酶填补，最终在受体DNA中新插入一个LINE。

复制型基因的克隆

将目的基因仍保留在染色体以外的克隆系统称为复制型基因克隆系统，以区别整合到染色体上的整合型克隆系统。尽管有大量不同的噬菌体，但所有已知的乳球菌复制型克隆系统都是由质粒构建的。

乳球菌遗传学研究证明，乳球菌含有数量不等的质粒，多则十几个。它们当中一些编码重要的代谢物质，为了分析和克隆这些基因，以及了解它们的命运，应当消除其内源性质粒。尽管有大量的质粒存在于乳球菌中，但许多质粒是隐蔽性的，这就推迟了内源性质粒在载体构建中的应用，同时由于一些相关的革兰氏阳性菌发展的载体也可在乳球菌中复制，并表达它们的抗性标记。因此，有两种本质不同的载体可以成功的用于乳球菌，它们分别用外源性的复制子和遗传背景清楚的乳球菌复制子构成，这两种不同的载体列于图1。

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