多连体

若干个结构相同的单体，按同一方向首尾相连构成的一个DNA长分子，即是一个线状多连体。λ噬菌体在其生长周期的某一阶段，能以“滚环”方式复制出很长的线性多连体。在基因重组过程中，λ噬菌体DNA基因复制的过程等都会形成DNA的多连体。

简介

若干个结构相同的单体，按同一方向首尾相连构成的一个DNA长分子，即是一个线状多连体。λ噬菌体

多连体DNA，在粘性质粒或λ噬菌体中构建的重组体，进行体外包装反应时，在高浓度的DNA及连接酶条件下所形成的多连体。

λ噬菌体DNA的复制形成多连体

在λ噬菌体感染的早期，环形的λ DNA分子按θ形式从双向进行复制，其复制的起点是位于cⅡ基因和O基因之间，并且需要O和P这两个基因编码的蛋白质分子的积极参与。到了感染的晚期，控制滚环复制机理的开关被启动了，合成出了由一系列线性排列的λ基因组DNA组成的长多连体分子。滚环复制机理的开关是受λ噬菌体gam基因产物控制的，它可以抑制大肠杆菌核酸外切酶V对复制中的DNA分子的作用(这种酶是由大肠杆菌recB和recC基因编码的，所以又叫做RecBC酶)。因此，在RecBC-的寄主细胞中，gam-的噬菌体只能产生出多连体的DNA分子。因为在噬菌体颗粒的包装成熟过程中，需要由λ噬菌体基因组DNA组成的多体分子参加；而在RecBC-寄主细胞中，gam-噬菌体只能产生出λ噬菌体基因组DNA的单体分子。因此在这种情况下，噬菌体颗粒成熟之前就要发生单体分子之间的重组作用。这种重组作用，是由噬菌体的red基因产物，或是寄主细胞的recA基因产物的作用所引起的。但无论是重组作用形成的，还是由滚环复制产生的λ噬菌体基因组DNA的多连体分子，都必须经过核酸酶的切割作用，从cos位点处将它分离成单位长度的单体分子之后，才能够被包装起来。已知有四种头部蛋白质参与了这种切割过程。

分子克隆过程中产生的DNA多连体

DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一。

连接的方法有：

(1)粘性末端连接

DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端，用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。在连接酶的作用下可恢复原样，有些限制性内切酶虽然识别不同顺序，却能产生相同末端。

(2)平头末端连接

用物理方法制备的DNA往往是平头末端，有些酶也可产生平头末端。平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来，但连接效率不如粘性末端高。

(3)同聚寡核苷酸末端连接。

(4)人工接头分子连接

在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段，经限制性内切酶作用后，就会产生粘性末端。

连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率。以λ或Cos质粒为载体时，形成线性多连体DNA分子，载体与DNA片段的比率高些为佳。以质粒为载体时，形成环状分子，比率常为1:1。

目的基因与克隆载体的体外重组形成多连体

DNA体外重组是将目的基因(外源DNA片段)用DNA连接酶在体外连接到合适的载体DNA上，这种重新组合的DNA称为重组DNA。

DNA体外重组技术，主要是依赖于限制酶和DNA连接酶的作用。在选择外源DNA同载体分子连接反应的程序时，一般需要考虑下列三个因素：①实验步骤要尽可能简单易行；②连接形成的接点序列，应能被某种限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段；③对转录和转译过程中密码结构的阅读应不发生干扰。

在连接反应中，正确地调整载体DNA和外源DNA之间的比例，是获得高产量的重组体转化子的一个重要因素。如果是使用质粒分子作为克隆的载体，其重组体分子是由一个载体分子和一个目的DNA片段连接环化而成的，故当载体DNA与目的DNA的比值为1时，便有利于这类重组体分子的形成；若是应用λ噬菌体或黏粒做载体时，配制高比值的载体DNA/给体DNA的连接反应体系，则有利于重组体分子的形成。以黏粒载体为例，因为只有当给体DNA片段的两个末端都同黏粒载体结合之后，才能被有效地包装。在体外连接反应中，DNA的总浓度对形成什么样的DNA分子类型同样也会有所影响。一般规律是，低浓度的DNA分子问的相互作用机会少，有利于环化作用；而高浓度的DNA，则有利于形成长的多连体DNA分子。此外，连接反应的温度也是影响连接效果的另一个重要因素。

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