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孚尔根染色法

生物学术语

DNA是主要的遗传物质，集中于染色体上。1924年孚尔根首先用席夫试剂(Schiff)作试验，鉴定了染色体上DNA的存在，故称为孚尔根染色法。孚尔根染色法的反应原理主要与席夫试剂的化学性质有关，此试剂的基本成分是碱性品红，偏亚硫酸氢钠(NaHSO3)和盐酸·碱性品红的主要成分是三氨基三苯甲烷氯化物。

简介
实验原理：细胞中的DNA受1mol/L HCl，60℃水解作用以后，核酸中的嘌呤碱很快完全被除掉，使脱氧核糖中潜在的醛基获得自由状态。水解后，组织要经水洗再移至希夫（Schiff）试剂中，希夫试剂即同露出来的醛基发生反应，呈现紫红色。这个反应是Feulgen在1942年提出来的，是DNA的一个特异性检查法。
水解的时间很重要，因为核酸的水解有两个过程，第一，嘌呤碱很快被除掉，脱氧核糖中潜在的醛基显露出来，第二，组蛋白和核酸愈来愈多地被除掉。在短时间的水解作用以后，第一个过程占优势，这时候用希夫试剂染色，染色体的染色作用最强。随着水解作用的继续进行，第二个过程逐渐变成优势，因此水解液中的希夫反应增强，而染色体中的希夫应减弱。最后，第二个过程超过第一过程时，染色体也随之停止反应。
希夫试剂是碱性品红———亚硫酸溶液，呈无色。与DNA醛基反应后，使碱性品红恢复原来的红色。
实验目的
观察蚕豆根尖细胞或其它根尖细胞内染色体中的DNA，以及染色体在有丝分裂中的行为，掌握Feulgen染色方法。
实验材料
上次实验制成了石蜡切片。
实验准备
1．用具 立式染色缸一套，镊子，盖玻片，小漏斗，铁架，毛边纸，玻璃棒，显微镜，恒温水浴锅，温度计，烧杯，棕色瓶，黑纸。
2．玻璃器皿的清洗 主要是染色缸的清洗，一般用肥皂粉洗，用水冲净即可，如不能洗净时，要用洗液浸泡后，再冲洗，自来水洗后，再用少量蒸馏水过洗一次。盛放100%酒精、二甲苯的染色缸必须干燥，缸盖内缘必须涂以几士林，以防止蒸发和收水分，影响浓度。染色缸上要贴上标签。
3．实验所需药口及配制
浓盐酸（36—38%），碱性品红，偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）;
亚硫酸钠（Na2SO3）,固绿（fast green），加拿大中性树胶乙醇（30—100%），二甲苯。
药品配制
1各种浓度的乙醇配制.
21NHCI配制：取浓HCI 82.5毫升加蒸馏水至1000毫升，摇匀。
3Sciff 试剂的配制
0．5克碱性品红，加到已经煮沸的100毫升蒸馏水中，再煮沸3—4分钟，待溶液冷却到50℃时过滤，再等溶液冷到25℃以下时，加入10毫升的1NHCI和1。5克偏重亚硫酸钠，装在棕色瓶中，塞紧瓶子，用黑纸包好，放在暗处，第二天观察，溶液还是淡红色就不能用，只得重配。
偏重亚硫酸钠与1NHCI反应，放出SO2，SO2与碱性品红反应，生成碱性品红--亚硫酸溶液，呈无色。
4漂染液的配制
先配10%的亚硫酸钠溶液。
把10%亚硫酸钠溶液10毫升加200毫升蒸馏水，再加10毫升1NHCI，即成漂当液。
5固绿染色液
0.5克固绿溶于100毫升95%乙醇溶液。
实验步骤
2．水解 先在恒温水浴箱中准备好恒温60℃的1NHCI。注意一定要控制好温度不能过高，高了醛基要破坏，低了水解不充分，醛基不能释放出来。水解的时间长短要根据材料，以及固定液的种类而定。根据试验结果，取一个适当时间。
因加拿大树胶溶于二甲苯，所以片子一定要经二甲苯透明后才进行封片，操作方法如下：
1.用镊子从二甲苯中取出载玻片，以毛边纸吸干余液。
2.左手开启树胶瓶，右手用瓶中玻璃棒蘸取树胶滴于载玻片上，并随即盖好瓶盖。树胶的用量视盖玻片大小而定。要使树胶在盖玻片下满布，不发生过多或不足。
3镊取洁净盖玻片，以一边浇于载玻片上，然后徐徐放下，使树胶布满盖玻片与载玻片之间。产生气泡的原因是覆盖太快树胶用量不足，或树胶过稠。气泡侵入后，妨碍镜检，且使标本褪色。如有气泡产生，则可以在靠近气泡的一边再滴树胶一滴，然后轻压盖玻片，使气泡逸出。
片子封片后，放在切片木框上，让其自然干燥，即可保存。
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