层析分离法

分离方法

层析分离法，简称层析法，亦称色谱层析法、色谱法、色层法。是利用样品中各组分的物理、化学性质的质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（称为固定相），另一个相则流过此固定相（称为流动相）并使各组分以不同速度移动，从而达到分离的方法。层析法和其他分离方法比较，具有分离效率高，操作又不太麻烦的优点。因此，层析法的应用越来越广，对于近代化学科学的发展有巨大的影响。在制药、化工、农业、医学等方面都有着广泛的应用。

层析分离法的概念

层析分离法，简称层析法，又称色谱法、色层法或层离法（Chromatography），是一种应用很广的分离分析方法。1903年，俄国的植物学家M，C．UBeT在研究分离植物色素过程中，首先创造了色谱法，这是一种根据化合物的不同结构和不同的物理，化学特性，从而具有不同吸附性能的原理，以分离混合物中的化学成分的一种物理化学分离方法，最初用于有色物质，之后应用于大量的无色物质。色谱法的名称虽然仍然沿用，但已失去原来的含义。层析法和其他分离方法比较，具有分离效率高，操作又不太麻烦的优点。因此，层析法的应用越来越广，对于近代化学科学的发展有巨大的影响。在制药、化工、农业、医学等方面都有着广泛的应用。

层析法的历史及原理

层析法的历史

1903年3月21日俄国植物学家茨维特（Michael Tswett，1872-1919）在华沙自然科学学会生物学会议上发表了“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”研究论文，介绍了一种应用吸附原理分离植物色素的新方法，并首先认识到这种层析现象在分离分析方面有重大价值。1906年他在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法（Chromatography）。1907年在德国生物学会年会上，展示过带有色带的分离柱管和纯化过的植物色素溶液。茨维特被世人公认为色谱创始人。

德籍奥地利化学家R.Kuhn 等利用他的方法在纤维状氧化铝和碳酸钙的吸附柱上将过去一个世纪以来公认为单一的结晶状胡萝卜素分离成a 和b 两个同分异构体，并由所取得的纯胡萝卜素确定出了其分子式。 Kuhn正是由于在维生素和胡萝卜素的离析与结构分析中取得了重大研究成果而获得了1938年诺贝尔化学奖。

1952年，Martin和James发表第一篇气液色谱论文，首次用气体作流动相，配合微量酸碱滴定，发明了气相色谱，它给挥发性化合物的分离测定带来了划时代的革命。

层析法的原理

层析法利用混合物中各组分的物理化学性质间的差异（溶解度、分子极性、分子大小、分子形状、吸附能力、分子亲合力等），使各组分在支持物上集中分布在不同区域，借此将各组分分离。

层析法进行时有两个相，一个相称为固定相，另一相称为流动相。由于各组分所受固定相的阻力和流动相的推力影响不同，各组分移动速度也各异，从而使各组分得到分离。

层析技术与待分离混合物中各组分的理化性质（分子自然形状、大小、获电状态、溶解度与选择性吸附剂或载体物的吸附能力，分配系数、酸碱环境、温度、极性以及分子的亲和能力等）有着直接关系。除此，任何层析技术，均具有两相条件，造成流动相对固定相作单向相对运动。这种流动相推动样品中各组分通过固定相向前迁移，其运动速率与两相物质和被分离物质状态有关。由于被分离物各组分中的理化性质不同，对不同的两组或两组以上组分，具有不同的作用力，通过吸附一解吸，或离子交换、分子筛效应、静电引力，免疫特异性吸附等，造成各组间生物分子分离、迁移距离不等，最终达到被测物的分离、纯化的目的。这一技术的应用，不但能分离有机化合物，还能分离无机物，更主要的是适合于分离分析生物高分子物质，其分离范围广，适用性强。化学性稳定、灵敏度高，既可纯化又可制备，条件简便。

层析法分类

层析法分类如下表所示：

几种典型层析方法概念

吸附层析

利用吸附层析介质表面的活性分子或活性基团，对流动相中不同溶质产生吸附作用，利用其对不同溶质吸附能力的强弱而进行分离的一种方法，称之为吸附层析。

分配层析

被分离组分在固定相和流动相中不断发生吸附和解吸附的作用，在移动的过程中物质在两相之间进行分配。利用被分离物质在两相中分配系数的差异而进行分离的一种方法，称之为分配层析。

离子交换层析

利用固定相介质表面活性基团，经化学键合方法，将具有交换能力的离子基团固定在固定相上面，这些离子基团可以与流动相中离子发生可逆性离子交换反应而进行分离，称为离子交换层析。

凝胶层析

利用凝胶层析介质(固定相)交联度的不同所形成的网状孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法，称之为凝胶层析。

亲和层析