明胶酶谱法

化学技术

酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。

原理

复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Triton中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min/次，做2次或15min/次，4次。静置于Trition中是不妥的。）时，由于SDS被Triton结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。

试剂的配制

（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高）

A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量）

10% SDS聚丙烯酰胺凝胶 10ml（包括）

ddH2O 4.5ml

30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺） 2ml

1.5mol/l Tris（pH 8.8） 2.5ml

10% SDS 100ul

10%过硫酸铵（APS） 100ul

TEMED 8ul

1%明胶（1g明胶--＞100ml，37°C水浴溶解） 1ml

B.浓缩胶的配制

浓缩胶 6ml

ddH2O 4.5ml

30%储备胶0.75ml

1mol/l Tris-HCl( pH 6.8) 0.76ml

10% SDS 60ul

10%过硫酸铵 60ul

TEMED 6ul

（2）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液

0.125mol/L Tris-HCl，1.25mol/L 甘氨酸，0.5%SDS（pH 8.3）

（3）4 ×上样缓冲液

0.32% Tris-HCl 6.4ml

4%SDS（pH7.2） 8ml

16%甘油 3.2 ml

溴酚蓝0.024g

ddH2O 2.4ml

(5) 洗脱液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris-HCl<6.057g/L> ，5mmol/L CaCl2<0.5549g/L>，pH7. 6 （40分钟两次，中间换液）

（6）漂洗液： 50mmol/L Tris-HCl， 5mmol/L CaCl2，pH7. 6 （20分钟2次）

（7）孵育液：50mmol/L Tris,pH7.5,150mmol/L NaCl,10mmol/L CaCl2,0.02% NaN3（孵育42小时）

（8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝 R-250，30%甲醇，10%乙酸（染色3小时）

（9）脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5% （分别30min、1h、2h脱色）

实验步骤

1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。

2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中 2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。

3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。与5×上样缓冲液混合，12ul样本+4ul上样缓冲液。（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）

4.配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100V约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。

5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/L CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃ 孵育42h。

6.孵育结束后经染色液(0.05% Coomassic 亮蓝、30%甲醇、10%乙酸) 染色3h,及脱色液A、B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%) 分别脱色0.5、1、2h后，显示出MMP-2（72KD）和MMP -9（92 KD）为位于蓝色背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。

注意事项

1.制备聚丙烯酰胺凝胶时应注意排除气泡。

2.明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和pH值等因素的影响，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。

3.用大梳子。

4.孵育液的pH最好在7.5-7.6，复性的Triton时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的。

5.孵育的37℃不要在CO2培养箱中，因为会改变孵育液的pH值，在普通孵箱即可。

6.明胶要4℃保存，配好后1周内使用

凝胶制备

1.玻璃板对齐后放入夹中，垂直卡紧，加满水检漏。

2.配10%分离胶，APS和TEMED作用为促凝，最后灌胶前加。若板不漏水，则将水倒出，并用吸水纸洗净后灌胶，灌至大约3/4处，上面加满水压平。

3.配浓缩胶，同样地，APS和TEMED最后加，分离胶灌入约30min后观察小烧杯中剩余分离胶是否已凝，同时仔细观察可见玻板水和胶间有一条折线，说明胶已凝固。

4.将上面的水倒去，吸水纸洗净，灌入浓缩胶，灌满，注意一定不要有气泡，然后将梳子插入，注意保持水平，约30min后凝固可用。