植物细胞融合

植物细胞工程的分支

植物细胞融合是植物细胞工程的一个重要分支，是一种突破物种生殖隔离、创造远缘杂种的新途径，原生质体技术还可用于细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入。植物细胞融合包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养，以及植株的再生和鉴定等环节。

定义

细胞融合，亦称细胞杂交，是指亲本的两个细胞在特定的物理和化学因子处理下合并为一个杂种细胞的过程。植物细胞融合可分为体细胞杂交和配子体细胞杂交，前者是指不经过有性过程，而直接由体细胞原生质体融

合产生杂种细胞，形成愈伤组织，并再生出植株的过程，后者是指性细胞（如小孢子四分体、精子、精细胞、幼嫩花粉、成熟花粉、卵细胞、助细胞和中央细胞等）原生质体和二倍体原生质体融合产生三倍体杂种细胞，形成愈伤组织，并再生出植株的过程。植物细胞融合是植物细胞工程的一个重要分支，是一种突破物种生殖隔离、创造远缘杂种的新途径，原生质体技术还可用于细胞突变体的筛选、细胞器移植和外源DNA的导入。

自1960年Cocking用酶法分离出番茄根原生质体后，Nataga和Takebe1970年首次利用烟草叶分离原生质体，经培养获得再生植株；1975年以色列的Vardi等首次从木本植物Shamonti甜橙珠心组织诱导胚性愈伤组织，并从愈伤组织分离原生质体，经培养通过胚状体再生出植株；在禾本科植物中，除在珍珠谷、紫狼尾草用悬浮细胞为材料，较早获得原生质体再生植株外，直到1985年Fujimura等率先在水稻原生质体培养中获得了再生植株，才出现了重大突破。现已从许多种内、种间、属间甚至亚科间的体细胞杂交获得杂种细胞系或杂种植株。随着多种植物原生质体的成功培养和融合技术的不断改进，植物细胞融合获得了巨大成功。植物细胞融合包括原生质体的制备、细胞融合的诱导、杂种细胞的筛选和培养，以及植株的再生和鉴定等环节。

原生质体获取

起始材料

起始材料及其生理状态对原生质体的制备及其活力有很大的影响。在以往的双子叶植物培养中，大多以叶片为分离原生质体的材料，近年来，起始材料的适用范围有了较大扩展。以愈伤组织、悬浮细胞和体细胞胚为材料制备原生质体是最主要的方式，禾本科植物原生质体培养获得成功的试验，几乎都是用从幼胚或成熟胚诱导形成的胚性愈伤组织或胚性细胞系来游离原生质体。采用这些材料制备原生质体方法简便、产量高、不污染、不易破碎。

基因型

同一植物不同基因型的原生质体脱分化与再分化所要求的条件不同，所以在相同条件下，不同品种的再生能力不同。基因型的选择在植物原生质体培养中起着重要作用，它不仅影响原生质体的产量和活力，而且还影响植株的再生。现有条件下，并不是所有植物种都能获得原生质体再生植株。为了提高原生质体培养的成功率，要采用多品种和适当品种作为原生质体培养的起始材料。

培养基

培养基对原生质体培养影响很大。为了使原生质体能持续生长、分化，最重要的条件之一是选择合适的培养基。在木本植物原生质体培养中，常用的培养基有MS，MT，WPM，KM8p等。利用KM8p经多次改进得到的培养基V-KM已成功地培养了200多种原生质体，是适用范围较广的原生质体培养基。在禾本科植物原生质体培养成功的例证中，常用的培养基是以MS，LS，Du，N6，KM等为基础改进而来的。

无机盐是培养基的主要成分，其浓度要比细胞培养时低。其中氮源研究较多，渗透压过高，原生质体会发生皱缩直至失去活力；渗透压过低，原生质体吸水膨胀而破碎，故在酶解和初培养时，由于原生质体无细胞壁，培养基保持较高的渗透势状态是必要的。随着原生体培养时间的延长，可逐步降低渗透势以提高细胞的耐受力。常用的碳源、渗透剂以葡萄糖较好，可获得较高的植板率，且对细胞毒害也小。

原生质体培养中的激素以生长素和细胞分裂素为主。不同植物的原生质体培养，对激素的浓度要求差异很大，需要生长素和细胞分裂素的适当搭配。但也有学者证明添加NAA可提高原生质体的分裂率。在禾本科植物原生质体培养中，培养基中2，4-D的作用十分重要。

培养方法

原生质体的培养方法分为液体培养、琼脂糖包埋和看护培养几种方式。有些植物适于采用液体浅层培养，另外，固液双层培养法也被应用于原生质体再生

培养密度

原生质体的接种密度对培养效果影响很大。密度过小，原生质体内含物外渗而引起褐变或进行一次分裂后即死亡；密度过高，造成营养不良，再生细胞团很小，而且很快停止生长。在一定范围内，原生质体具有较强的恢复分裂能力，一般密度以104-105mL-1为宜。

酶制剂

在木本植物中，原生质体的分离常用的酶为纤维素酶、果胶酶、离析酶和半纤维素酶。但不同植物所用酶的种类有较大的差别。在苹果和山桃的原生质体分离中只需纤维素酶和果胶酶即可，枣树则用纤维素酶和离析酶。禾本科植物原生质体的分离普遍使用了Y-23果胶酶来消除细胞壁，保证了原生质体的质量。

材料的预处理

许多研究者报道，酶解之前对材料进行预处理有利于原生质体的分离。在正常培养基中生长的草莓试管苗幼叶，直接酶解仅能产生少量原生质体，如果在分离前将试管苗转入降低了蔗糖浓度的培养基中预处理2-3周，或暗处1周，原生质体的产量将大为提高。在实验中，材料是否需要预处理要根据不同的情况而定。

原生质体融合

原生质体融合方法

原生质体的融合方法经历了一个逐步改进和完善的过程。在早期原生质体融合的方法有NaNO3法、高pH/高Ca2+法、PEG（聚乙二醇）法，后来逐渐发展为PEG与高Ca2+、高pH相结合；20世纪80年代初又开始探索使用电融合法，并发展出一些其他方法。这些方法各有特点，但广泛使用的是PEG法和电融合法。

配子-体细胞原生质体融合技术主要借鉴了体细胞原生质体的融合方法。性细胞原生质体对融合处理很敏感，容易与其它原生质体融合。但是因为它的形态、密度等多不同于体细胞原生质体，其融合技术与体细胞杂交有所差异。影响因素主要有融合处理方式、原生质体密度与比率、融合诱导剂的浓度等。性细胞原生质体往往形体小而密度大，为了提高融合效率，通常在提高性细胞原生质体密度的同时，相对降低后者的密度，以寻求最佳比例

原生质体融合的方式

原生质体的融合方式有两种：对称融合和非对称融合。通过这两种融合方式可产生3种类型的杂种：对称杂种、非对称杂种和胞质杂种。

筛选和鉴定

杂种细胞的筛选

在原生质体融合后的群体中，有融合体、未融合体、多元融合体和嵌合体，杂种细胞的筛选就是从中区分出预期的融合重组类型。主要的筛选方法有3种：①突变细胞互补选择法。包括遗传互补、营养缺陷互补、白化突变体之间互补以及生长激素的自主互补等。该方法的局限性在于突变体不易获得，而且有些突变体不易再生，所以尚未得到广泛应用。②根据原生质体特性差异的机械选择法。例如根据愈伤组织的颜色、荧光特性等在显微镜下机械分离杂种细胞。当以荧光特性作为根据时，可采用流式细胞光度计来区分杂种细胞，该法不但准确，而且效率高，用荧光化合物标记原生质体并不影响细胞再生植株的能力，但由于仪器价格昂贵，使用者还很少。③根据杂种细胞生长差异的选择法。

一般地，配子-体细胞杂交产生杂种细胞的筛选方法是：性细胞原生质体被异硫氰酸荧光素或DAPI预染后，再与体细胞原生质体融合，在荧光显微镜下可清楚地完成杂种细胞的鉴定。

杂种细胞的鉴定

获得再生植株后，必须进一步证实杂种的真实性并了解它与亲本的联系与区别。除了传统的形态学、细胞学及生化方法得到了继续发展外，近年来基因组DNA的RAPD和AELP分析以及细胞器DNA的Southern杂交分析广泛应用于对称或不对称杂种细胞鉴定。

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