淋巴管内皮

医学名词

淋巴管内皮细胞（lymphatic endothelial cells, LEC）是构成淋巴管壁的主要结构，参与维持体液平衡、调节淋巴细胞再循环和机体免疫反应等生理过程. 近年研究表明，LEC还在伤口愈合、淋巴管水肿和炎症扩散等病理过程中起重要作用，而且与肿瘤转移密切相关[1]. 但是，由于原代分离和体外培养LEC均比较困难，国内外有关此方面的报道较少，且多集中于牛、猪等大型动物和人身上，因此大大限制了人们对LEC的认识和研究. 我们应用不完全弗氏佐剂诱导小鼠腹腔淋巴管瘤形成为细胞来源，以自制鼠尾胶作为贴黏剂培养LEC，旨在建立一个简便、廉价和稳定的小鼠LEC培养体系.

1材料和方法.1.1材料雌性健康Balb/c小鼠10只（第三军医大学大坪医院动物实验中心），4～6 wk龄，体质量（19.1±1.3） g；雄性健康SD大鼠2只（第三军医大学大坪医院动物实验中心），12 wk龄，体质量（230.4±15.4） g. 含多种生长因子的EBM2培养基（英国Cambrex公司）；胎牛血清（FBS，美国HYclone公司）；不完全弗式佐剂（美国Sigma公司）；兔抗鼠VEGFR3抗体，兔抗鼠LYVE1抗体（美国Santa cruz公司）；FITC标记的羊抗兔IgG（武汉博士德公司）；3HTdR（北京原子能研究所）. 乌拉坦（1 mL/100 g）ip麻醉大鼠，剪下鼠尾，750 mL/L乙醇消毒3 min. 去皮，950 mL/L乙醇固定15 min. 抽出肌腱，750 mL/L乙醇消毒30 min，三蒸水反复冲冼以去除残余乙醇. 充分剪碎，移入三角烧杯，加入5 mL/L醋酸溶液200 mL，4℃摇动过夜. 次日吸取上层液体，4000 r/min离心30 min，收集上清即为鼠尾胶. 取少量鼠尾胶加入培养瓶中（以全部覆盖瓶底为宜），5 min后吸掉鼠尾胶，室温放置过夜以备培养LEC之用；按同法包被下述实验需要的培养板和制备爬片所需的盖玻片. 按参考文献[2]将不完全弗氏佐剂与PBS按1∶1混匀，制成乳悬液. 取8只小鼠，ip 0.2 mL；15 d后加强注射1次. 2 mo后处死小鼠. 另设2只小鼠注射相同体积的无菌PBS作为对照.

1.2方法打开小鼠腹腔，取出淋巴管瘤. 将其剪碎成约0.5 mm3大小，加入I型和II型胶原酶1∶1配成的1 g/L溶液5 mL，37℃恒温摇床消化组织块30 min，800 r/min离心10 min收集细胞，残余组织块用2.5 g/L胰蛋白酶+0.2 g/L EDTA溶液37℃摇床消化15 min，离心收集细胞，将两次收集的细胞混合，80 μm尼龙网过滤，台盼蓝计数. 之后，将细胞接种到鼠尾胶包被的培养瓶中，使用含多种生长因子的EBM2完全培养基，37℃，50 mL/L CO2孵箱中培养.

1.2.1LEC的鉴定取培养2～3代的LEC 1×106个接种于鼠尾胶包被的6孔培养板中，同时分别将鼠尾胶包被的盖玻片置于其中. 24 h后取出盖玻片，40 g/L甲醛固定20 min. 30 mL/L H2O2室温封闭10 min后，再用20 mL/L山羊血清封闭20 min. 分别以兔抗鼠VEGFR3抗体或LYVE1抗体和FITC标记的羊抗兔IgG为一抗和二抗进行免疫荧光检测，以PBS代替一抗作为阴性对照.

1.2.2LEC的增殖活力测定取培养2～3代的LEC于实验前晚半量换液，实验时取1×106个，以不含FBS和生长因子的培养液洗涤3次，最后将细胞悬浮于0.5 mL完全培养液中；加3HTdR 370 kBq，放入孵箱孵育3 h，每0.5 h轻摇1次；标记结束时加FBS数滴，洗去游离同位素，加完全培养液洗浴30 min，调整细胞密度2×108/L备用. 取LEC 0.25 mL/孔（5×104/孔）接种于鼠尾胶包被的24孔板，随机分组为：①空白对照组（使用不含生长因子和FBS的EBM2培养基）；②无生长因子组（使用只含FBS的EBM2培养基）；③无FBS组（使用只含生长因子的EBM2培养基）；④完全培养基组（使用既含生长因子又含FBS的EBM2培养基）. 在孵箱中作用20 h后，低速离心5 min，轻弃上清0.1 mL；加混合酶（8 g/L胰蛋白酶与0.5 g/L DNA酶在作用前对倍稀释而成）0.1 mL，作用30 min后，收集细胞于玻璃纤维滤纸上，烘干后放入闪烁杯送检cpm，换算成Bq，代表3HTdR的掺入量，反映LEC的增殖状况. 每份设3个复孔，取其平均值计算. 另按1×104/孔接种LEC于24孔培养板，分别在1，6，12，24，48，72，96，120 h取3孔计数活细胞（4 g/L台盼蓝拒染），实验重复3 次，取其平均值，绘出生长曲线，并按公式DT=t log2/(log Nt-log No)计算其细胞倍增时间. t表示对数生长期细胞培养时间，Nt为对数生长期终末时的细胞数，No为对数生长期起始时的细胞数. 以未用鼠尾胶包被的培养孔作为对照.

1.2.3淋巴管形成试验先将鼠尾胶铺满6孔培养板底部，置浓氨水棉球片刻，1 h后即形成胶原凝胶. 每孔接种1×105个LEC，补加完全培养液适量，置于37℃，50 mL/L CO2孵箱培养. 每天使用相差倒置显微镜观察淋巴管样结构形成的情况. 以未用鼠尾胶包被的培养孔作为对照.统计学处理：计量资料以x±s表示，采用统计软件SPSS 11.0分析，组间比较用非参数秩和检验.

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