生物发酵提纯技术

利用微生物的特定性状和功能用于工业化生产获得目的产物的技术体系

生物发酵提纯就是利用微生物的特定性状和功能，通过现代化工程技术和设备来生产有用物质或将微生物直接用于工业化生产获得目的产物的技术体系。包括发酵和提纯两个工序。提纯是将所需要的产物从发酵液中分离出来的过程，也称后处理。主要包括细胞破碎，分离，醪液输送，过滤除杂，离子交换电渗析，逆渗透，超滤，凝胶过滤（层析），沉淀分离，溶媒萃取，蒸发，结晶，蒸馏，干燥包装等过程和单元操作。

什么是发酵

发酵就是将微生物接种到合适的培养基中，通过控制其生长和代谢环境，来使微生物发挥起独特功能的过程。其主要内容包括菌种的选育，种子的扩大培养，培养基的配制与灭菌，接种及发酵控制等。

发酵的类型

从不同的角度可将发酵分成不同的类型。根据是否需要氧气可分为厌氧发酵（静置发酵）和好氧发酵（通气发酵）；根据发酵培养基的性质可分为固态发酵和液态发酵；根据发酵方式的不同可分为分批发酵、补料分批发酵及连续发酵等。

化妆品发酵

厌氧发酵

适用于厌氧或兼性厌氧微生物的发酵，如丙酮丁醇发酵、酵母菌的酒精发酵、乳酸发酵等。产生丙酮、丁醇的梭状芽孢杆菌（Clostridium）是一种专性厌氧微生物，它的菌体发酵和发酵应在无氧条件下进行。酵母菌是一类兼性厌氧微生物，根据其生理特点，在种子制备时应在搅拌通风的条件下进行以促使其生长繁殖，而酒精发酵则在缺氧条件下进行。乳酸菌大多属耐气性厌氧菌，它们的生长和代谢产物合成与氧的有无关系不大，但为了防止杂菌污染，还是以缺氧环境中发酵为宜。

液态发酵

指发酵培养基的状态为液体。绝大多数纯种发酵都为液态发酵，如青霉素发酵。早期的青霉素发酵在液体浅盘上进行，由于该法存在产量低、易污染且劳动强度大等缺点，现已被深层液体通风发酵法取代。

深层液体通风发酵在密闭通风发酵罐中进行，将种子接入灭菌的发酵培养基中，然后在适宜的温度、溶氧下发酵，发酵罐中有蛇管或夹套可以控温，溶解氧的浓度可以通过调节搅拌机转速或通入的无菌空气的风量来控制。

分批发酵

指在发酵过程中，除了不断进行通气（好氧发酵）和为调节发酵液的pH而加入酸碱溶液外，与外界没有其它物料交换的一种发酵方式。培养基的量一次性加入，产品一次性收获，广泛采用的一种发酵方式。其优点是：①对温度的要求低，工艺操作简单；②比较容易解决杂菌污染和菌种退化等问题；③对营养物的利用效率较高，产物浓度也比连续发酵要高。缺点是：①人力、物力、动力消耗较大；②生产周期较长，由于分批发酵时菌体有一定的生长规律，都要经历延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期，而且每批发酵都要经菌种扩大发酵、设备冲洗、灭菌等阶段；③生产效率低，生产上常以体积生产率（以每小时每升发酵物中代谢产物的g数来表示）来计算效率，在分批发酵过程中，必须计算全过程的生产率，即时间不仅包括发酵时间，而且也包括放料、洗罐、加料、灭菌等时间。

提纯的步骤

固液分离

不管所需要的发酵产物是胞外代谢产物，还是胞内物质，甚至是菌体本身，首先都要进行固液分离，从发酵液中将细胞或其他固形物分开。其方法主要有预处理、过滤、离心和沉降。

有效成分提取

（1）、细胞破碎要提取细胞内的酶、多糖和核酸等，必须首先破碎细胞。基因工程产物，大都积累在细胞内，要获得这些产物，也必须先把细胞破碎。

（2）、浓缩和沉淀浓缩是将低浓度溶液除去一定量溶剂（包括水）变为高浓度溶液的过程，常见的有蒸发浓缩、冷冻浓缩和吸收浓缩等三种。

（3）、离子交换及吸附许多生物物质是两性物质，随着溶液pH值的不同，可以以阳离子、阴离子和偶极离子三种形式存在。这些分子能依靠静电力可逆地结合在离子交换树脂上。吸附可有两个目的，其一是将发酵产品吸附并浓缩于吸附剂上，其二是用吸附剂去除发酵液中的杂质或有害物质。

（4）、蒸馏是分离液体混合物的一种有效方法，是基于发酵产物的沸点不同，将所需物质从液体混合物中分离出来的过程。

（5）、萃取将某种特定溶剂，加到发酵液混合物中，根据发酵液组分在水相和有机相中的溶解度不同，将所需物质分离出来的过程。此法常用于抗生素的分离工作中。如将抗生素发酵液与某一有机溶剂混合，并调节至适当的pH，大部分抗生素即溶于有机相中。有机相分离出来后，再调节pH，可使抗生素转至水相中，如此反复可得到较纯的抗生素。红曲发酵液中红色素的提取也可用此法。萃取法具有传质速度快、生产周期短、便于连续操作、可自动控制、分离效率高、生产能力大等优点，所以应用相当普遍。

超临萃取技术

由于技术的发展，萃取不一定在水相与有机相之间进行，发展出了双水相萃取法、反胶束萃取法和超临界流体萃取法等新技术。化妆品界应用较多的为超临界流体萃取技术。其具有以下特点：

1、超临界萃取可以在接近室温(35～40℃)及CO2气体笼罩下进行提取，有效地防止了热敏性物质的氧化和逸散。因此，在萃取物中保持着药用植物的有效成分，而且能把高沸点、低挥发性、易热解的物质在远低于其沸点温度下萃取出来；

2、使用SFE是最干净的提取方法，由于全过程不用有机溶剂，因此萃取物绝无残留的溶剂物质，从而防止了提取过程中对人体有害物的存在和对环境的污染，保证了100%的纯天然性；

3、萃取和分离合二为一，当饱和的溶解物的CO2流体进入分离器时，由于压力的下降或温度的变化，使得CO2与萃取物迅速成为两相（气液分离）而立即分开，不仅萃取的效率高而且能耗较少，提高了生产效率也降低了费用成本；

4、CO2是一种不活泼的气体，萃取过程中不发生化学反应，且属于不燃性气体，无味、无臭、无毒、安全性非常好；

5、CO2气体价格便宜，纯度高，容易制取，且在生产中可以重复循环使用，从而有效地降低了成本；

6、压力和温度都可以成为调节萃取过程的参数，通过改变温度和压力达到萃取的目的，压力固定通过改变温度也同样可以将物质分离开来；反之，将温度固定，通过降低压力使萃取物分离，因此工艺简单容易掌握，而且萃取的速度快。

（6）、层析当发酵液浓缩物随流动相流经装有固定相的层析柱时，混合物中各物质因分子大小不同而被分离的技术，是1960年代才发展起来的快速、简便而高效的分离技术，应用非常广泛，如可用于脱盐、去除热源物质、浓缩高分子溶液、测定相对分子量、纯化抗生素等领域。其原理是基于被分离物质分子大小的不同，大分子物质不易进入凝胶颗粒（固定相）的微孔，因此向下流动的速度快；小分子物质除了可在凝胶颗粒间扩散外，还可进入凝胶的微孔中，因此向下流动的速度慢。

已发展出了气相色谱、中压液相色谱、高效液相色谱等新方法来分离样品。

层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。

（7）、膜分离依靠特定的膜允许物质透过或被截留的过程。膜分离近似于筛分过程，依据滤膜孔径的大小而达到分离的目的。按分离粒子或分子大小的不同，分为透析、电渗析、微滤、超滤、反渗透和纳米过滤等六种过程。应用在化妆品领域的主要为微滤，鉴于微孔滤膜的分离特征，微孔滤膜的应用范围主要是从气相和液相中截留微粒、细菌以及其他污染物，以达到净化、分离、浓缩的目的。

提纯关键步骤

生物提纯在提取环节中的关键步骤包括：萃取、层析和膜分离。

发酵产品的后加工

（1）结晶是制备纯物质的一种有效方法。结晶过程因具有高度选择性，只有同类分子或离子才能形成结晶，所以析出的晶体很纯。在发酵工业中，结晶广泛用于抗生素、氨基酸、有机酸、糖、核苷酸、维生素、辅酶等小分子的生产。

（2）干燥生物产品含水易引起水解变性，影响质量，所以必须进行干燥处理。工业上干燥设备很多，但因生物制品大多为热敏性物质，易变性失活，所以用于生化产品的干燥必须快速高效，加热温度不能过高，产品与干燥介质的接触时间不能太长，而且为防止杂质混入和保持洁净干燥，干燥过程必须在密闭条件下进行。

生物发酵提纯技术的优势

传统方法获取的一些植物精油和植物精华，纯度和活性一般在20%—30%左右。而用生物发酵提纯技术获取的植物活性精华与植物精油纯度均可高达99.99%。

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