生物活性

生物特性

生物活性是指能引起细胞正常机理发生改变的能力。在材料领域里主要指能在材料与生物组织界面上诱发特殊生物、化学反应的特性，这种反应导致材料和生物组织间形成化学键合。在生物矿化过程中，主要指生物材料与活体骨产生化学键合的能力，是衡量生物材料的一个重要指标，可通过材料表面在人体模拟体液（simulated body fluid-SBF）中形成磷灰石的能力能够反应材料在体内的生物活性，此评价材料生物活性方法的应用可以减少实验所需动物数量，同时增加动物实验的可持续时间.

理论背景

该概念是在 1969 年美国人 L.Hench 在研究生物玻璃时发现并提出，进而在生物陶瓷领域引入了生物活性概念，开创了新的研究领域。经过 30 多年来的发展，生物活性的概念在生物材料领域已建立了牢固的基础，如β-磷酸三钙可吸收生物陶瓷等，在体内可被降解吸收并为新生组织代替，具有诱出特殊生物反应的作用；羟基磷灰石由于是自然骨的主要无机成分，故植入体内不仅能传导成骨，而且能与新骨形成骨键合，在肌肉、韧带或皮下种植时，能与组织密合，无炎症或刺激反应。生物活材料具有的这些特殊的生物学性质，有利于人体组织的修复，是生物材料研究和发展的一个重要方向。

常见材料

磷酸钙材料

磷酸钙生物活性材料主要包括磷酸钙骨水泥和磷酸钙陶瓷纤维两类。前者是一种广泛用于骨修补和固定关节的新型材料，国内研究抗压强度已达60MPa以上。后者具有一定的机械强度和生物活性，可用于无机骨水泥的补强及制备有机与无机复合型植人材料。磷酸钙纤维或晶须具有良好的生物活性和生物相容性，对人体无毒副作用，是生物陶瓷材料和有机高分子材料的理想增强材料。

羟基磷灰石

羟基磷灰石是目前研究最多的生物活性材料之一，作为最有代表性的生物活性陶瓷-羟基磷灰石[Ca10(P04)6(OH)2，简称HA] 。羟基磷灰石与脊椎动物骨和齿的主要无机成分相同，结构也非常相近，与动物体组织的相容性好，无毒副作用，界面活性优于各类医用钛合金、硅橡胶及植骨用碳素材料。可广泛应用于生物硬组织的修复和替换材料，如口腔种植、牙槽脊增高、耳小骨替换、脊椎骨替换等多个方面。另外，在HA生物陶瓷中耳通气引流管、颌面骨、鼻梁、假眼球以及填充用HA颗粒和抑制癌细胞用HA微晶粉方面也有广泛的应用。羟基磷灰石受到本身脆性高、抗折强度低的限制，因此在承重材料应用方面受到了限制。目前制备多孔陶瓷和复合材料是该材料的重要发展方向，制备涂层材料也是其重要分支之一。

生物活性玻璃

生物活性玻璃是一类能对机体组织进行修复、替代与再生、具有能使组织和材料之间形成键合作用的材料。生物活性玻璃（bioactiveglass，BAG）在1969年由Hench发现，由SiO2，Na2O，CaO和P2O5等基本成分组成的硅酸盐玻璃。生物活性玻璃的降解产物能够促进生长因子的生成、促进细胞的繁衍、增强成骨细胞的基因表达和骨组织的生长。是迄今为止唯一既能够与骨组织成键结合，同时又能与软组织相连接的人工生物材料。

活性检测

成骨活性

材料表面在 SBF 中形成磷灰石的能力能够反应材料在体内的生物活性，具体检测方法如下：

1.SBF 配置

由于SBF 溶液对于磷灰石过饱和，所以配备方法不恰当会导致溶液中磷灰石沉淀产生。整个配备过程需要确保溶液无色、透明，容器表面无沉淀出现，如果过程中产生沉淀，倒去溶液，洗净仪器重新配制。准备一个 1000ml 的塑料烧杯。首先于塑料烧杯中装好 700ml 离子交换蒸馏水、一个适当大小磁子，杯口密封以蒸发皿或塑料薄膜。搅拌并调节水温至 36.5±1.5C。

按表1所列顺序在 36.5C 恒温下逐个溶解第一到第八个化合物，溶解过程

表1 配置1000 ml SBF 溶液时试剂添加顺序、添加量

2.磷灰石形成能力测试

对于密质薄片材料，测出样品尺寸并计算样品表面积精确到 2mm 应用如下公式计算出 SBF 用量：

Vs=Sa/10,

Vs（ml）是 SBF 的体积量，Sa（mm）表示样品的表面积。

对于多孔材料，SBF 的用量应大于上式计算量准备好塑料瓶或烧杯，装入计算出的 SBF 体积量加热到 36.5C，然后按示意图往里放置样品。笔记：样品在容器中放置有两种情况，如图 1(a)，1(b)。少数情况下，SBF 溶液会生成同质磷灰石沉积于样品表面。所以如果样品放置是图 A1(b)种情况，表征实验应该检测样品的下表面。四个星期内，分别取出恒温浸透不同时长的各组样品，纯水轻盈洗净。然后将样品放入干燥器中常温干燥。

图1 SBF中样品浸泡示意图

细胞活性

1.四唑盐（MTT）比色法：

检测细胞存活和生长的方法除前面所介绍的方法外，还可用四唑盐比色法试验（MTT）。此法的原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，而细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶联免疫检测，以在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反应活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。

●0.25%胰蛋白酶消化细胞使其成为单细胞，用含0.1%胎牛血清的RPMI培养基配成1x10^9个/L的但细胞悬液，将细胞接种于96孔培养板中，每孔100ul。

●将培养板置CO2培养箱中，在37℃、5%CO2条件下，培养3-5天。

●培养3-5天后，每孔加入MTT溶液10ul，继续置培养箱孵育3-6h，终止培养，加10%SDS-HCl 100ul/孔，37℃培养数小时，将细胞内与细胞周围的MTT颗粒充分溶解。

●用酶联免疫检测仪测定每孔吸光度（OD），选波长490nm。以时间为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。

用此法测细胞活力，为保证结果的准确性，最好在试验前测定每种细胞的贴比率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，再确定每孔细胞接种数和培养时间，以保证培养终止时不会过满。另外，实验时设空白对照，比色时，以空白孔调零。

3.2.2 CCK-8 法

Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

● 制备细胞悬液：细胞计数

● 接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。

● 37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。

●加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。

●培养1-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。

●测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

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