硅胶柱

色谱柱填料

硅胶因其优良的机械强度和表面易改性等特征，已成为应用最广泛的色谱柱填料。硅胶柱具有柱效高、选择性好及分析速度快等特点，因而被广泛用于分离极性小分子如药物，而用于糖、肽或蛋白质分离较少。

亲水作用机理

硅胶

硅胶在色谱技术中应用最广，其在效率、硬度及性能方面均优于其他填料。硅胶填料分为A，B及C3种类型。A型硅胶为最早的通用型色谱填料，通常被金属污染，不适用于亲水作用色谱（HILIC）；B型硅胶为球形颗粒，金属杂质含量低，在中性到高pH(至少pH 9)范围内相对稳定；C型硅胶为“氢化硅胶”，与经典的硅胶在化学结构方面有很大不同，经典硅胶表面主要为极性硅醇基(Si—OH)，而C型硅胶表面主要为硅一氢(Si—H)基团，用“含水正相”(aqueous normal phase，ANP)描述在此类硅胶相上的分离，与“经典的”HILIC分离区别，然而ANP通常被认为是替代HILIC的另一名词。C型硅胶极性较低，对水的吸附少，不仅改善了保留的重现性，而且为HILIC中弱极性化合物的分离提供了新的选择性。除了这些最初主要用于非水流动相中的硅胶外，其他专门用于水有机流动相的硅胶材料具有较少的表面硅醇基，如Atlantis HIUC Silica，是当前HILIC应用中最常用的固定相。也有核一壳表面多孔颗粒(Halo)及未衍生的亚乙基桥杂化(BEH)颗粒用于HILIC分离的报道。商品化的硅胶填料在纯度上有所不同，取决于制备技术。因此，不同厂家的硅胶柱在保留性能、柱效及峰形上有很大差异，但具有相似的选择性。

硅胶表面含有Si—OH和硅氧烷(Si—O—Si)两种基团。Si—OH为强吸附点，而Si一0一Si具有疏水性。尽管HILIC概念于1990年提出，但早在20世纪80年代，这种以未键合硅胶为色柱，采用反相流动相的色谱模式已用于碱性化合物的分离，并提出该色谱模式下碱性化合物在硅胶柱上的保留存在离子交换机理。以未键合硅胶为色谱柱的HILIC中分析物保留主要受两种作用控制，(1)固定相表面富水层与疏水性更强的流动相之间的分配作用，(2)与固定相上薄层水之间的氢键作用。

分离机理

HILIC的分离机理仍存在着争议，普遍认为，在水有机流动相中，溶质在硅胶柱上的HILIC保留机理较复杂，包括分配作用、离子交换、氢键作用和静电作用，甚至包括在低有机溶剂浓度时与Si—O—Si疏水作用的反相保留。后来一些学者也证实了HILIC模式下碱性化合物在硅胶柱上的复杂保留机理。总的来说，HILIC保留机理主要取决于分析物的质、流动相组成及色谱柱特性，这种复杂机理会导致相同固定相对不同溶质的保留表现出较大差异。

当前，HILIC保留机理仍是色谱界的研究热点。一些作者通过考察不同性质化合物在不同HILIC色谱柱上的保留行为，进一步揭示及确证HILIC保留机理。如McCalley考察了中性、强酸性及强碱性化合物在硅胶、酰胺柱、二醇基柱及两性离子柱上的保留行为，实验数据证实HILIC机理非常复杂，包括分配、吸附、离子作用及疏水作用。当水含量较高时，对于大多数极性溶质常观察到logk与水相体积分数之间呈线性关系，但Jin及其合作者考察了核苷在6种不同极性固定相包3种硅胶柱(Atlantis HILIC silica，Venusil HILIC及BEH HILIC)及3种合成固定相上保留随流动相中水含量的变化，腺苷无论用分配模型还是吸附模型在6根色谱柱上都不存在线性关系。他们提出了HILIC中描述极性溶质保留行为的新方程式：

Ink=a+blnCB+cCB

式中CB为流动相中水相体积分数。常数口与溶质的分子体积相关，b与溶质一固定相作用有关，c与溶质及溶剂之间作用能有关。该模型说明了HIHC中溶质保留是一个复杂工程，不完全是受一种机理控制(如分配或吸附)，以哪一种机理为主则取决于溶质的性质、极性固定相性质及流动相组成。

影响因素

未键合硅胶仍然是HILIC中广泛使用的固定相，尤其是在生物分析领域。由于HILIC流动相中水相含量较高，在NPLC中硅胶色谱柱所引起的溶质不可逆吸附及保留重现性差等问题在HILIC中并不是难题。用于HILIC的硅胶柱使用有机溶剂(如水及乙腈)填充及储存，而不是正相溶剂。研究发现，不同的A型硅胶柱性能存在较大差异，这可能是因为A型硅胶纯度低，金属杂质的含量不同且含量较高；而B型硅胶柱的色谱性能相似，如McCalley比较了几种不同酸性、碱性及中性化合物在3种不同B型硅胶柱上的分离情况，发现所考察化合物在3种色谱柱上的保留时间及分离选择性均相似。此外，Heaton及其合作者还发现B型硅胶与C型硅胶也具有非常相似的保留选择性。亚乙基桥杂化(BEH)硅胶中约三分之一的表面Si—OH被除去，因此减弱了与si—OH作用的化合物的保留，由于乙基桥链的嵌入使得BEH颗粒表面pX。及残留表面Si—OH的带电状态与经典的硅胶表面不同，影其保留性能。

硅胶填料的制备丰要以硅酸盐和有机硅氧烷作为前驱体，使用氢氧化钠或氢氧化钠和氨水作为催化剂，因此不可避免地会引入金属杂质(如钠、铁、铝等)．这些金属杂质不仅对硅胶的结构和化学特性产生显著影响，而且某些金属可能成为小的活性中心或催化点，从而导致填料具有催化性质和非特异性吸附特性．另外，利用二氧化硅水溶胶制备多孔色谱硅胶时，如果二氧化硅水溶胶中含有较多钠离子杂质时，在高温焙烧过程中钠离子与二氧化硅的玻璃化会导致硅胶孔结构发牛塌陷和阻塞。杨俊佼等在氨水和氨气催化下使单晶硅粉水解，合成了单分散、高纯的纳米二氧化硅水溶胶；再利用聚合诱导胶体凝聚法(PICA)制备单分散脲醛二氧化硅复合微球，经过高温煅烧后得到球形硅胶色谱柱填料．通过电感耦合等离子一质谱(ICP—MS)、电子显微镜和BET比表面积测试等手段对球形硅胶的纯度、粒径分布及比表面积进行了表征，并通过色谱分离对硅胶填料的性能进行了评价。实验结果表明，该方法合成的色谱柱填料具有纯度高、粒径分布均匀、机械强度高及分离能力强等优点。

柱效测定

柱效是色谱柱对色谱中两种物质分离能力的大小。高效液相色谱法 (HPLC)柱效测定的高低，不仅反映出填料性能，有时也反映出装填技术的好坏。所以，测定柱效无论对生产填料或预装柱的生产者，还是对使用填料或预装柱的色谱工作者来说，都是很重要的。通过柱效的测定，生产者可以比较准确地进行质量控制，色谱工作者可根据测定的柱效选择合适的色谱柱和监督色谱柱使用过程中是否被污染。不同的色谱柱，固然有不同的柱效；但同一根色谱柱，测定柱效使用的方法不同，例如所用的化合物、流动相、流动相流速、温度、进样量、进样体积、半峰宽的测量等等不同，所得到的理论塔板数也不相同。当然，可以对所测定的柱效附上有关的实验条件，但是，若将柱效的测定方法趋于一致，测定条件大致相同，生产者和色谱工作者会更加方便。

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