硫酸盐还原菌

独特的原核生理群组

硫酸盐还原菌（Sulfate-Reducing Bacteria，简称SRB）是一类独特的原核生理群组，是一类具有各种形态特征，能通过异化作用将硫酸盐作为有机物的电子受体进行硫酸盐还原的严格厌氧菌。SRB在地球上分布很广泛，通过多种相互作用发挥诸多潜力，尤其在微生物的代谢等活动中造成的缺氧的水陆环境，如土壤、海水、河水、地下管道以及油气井、淹水稻田土壤、河流和湖泊沉积物、沼泥等富含有机质和硫酸盐的厌氧生境和某些极端环境。

研究历程

早在1924年，BENGOUGH和MAY就认为SRB产生的H2S对埋在地下的铁构件的腐蚀起着重要作用，1934年，荷兰学者库尔和维卢特提出了SRB对金属腐蚀作用的机制；随后，邦克（1939）、HEDELAI（1940）、史塔克和威特（1945）也证实腐蚀的主要细菌有铁细菌（好氧）和SRB（厌氧），土壤中钢铁的腐蚀主要是后者。

研究表明在无氧或极少氧情况下，它能利用金属表面的有机物作为碳源，并利用细菌生物膜内产生的氢，将硫酸盐还原成硫化氢，从氧化还原反应中获得生存的能量。

根据硫酸盐还原菌的生长繁殖条件、腐蚀活动机制和作用对象等因素，SRB腐蚀的防治可以分为物理方法、化学方法、阴极保护方法、微生物保护方法和防腐材料保护方法等几种。

但上述一些方法不是杀菌效率降低、就是花费较为昂贵。而且像某些化学方法（杀菌剂）的使用，也给环境治理带来新的负担。随着人们环保意识日益加强，研制和开发新的高效环保型防治方法就显得尤为重要，防止SRB腐蚀已是腐蚀科学和微生物学共同关注的课题。一些防腐专家认为从环境的角度考虑，SRB的防治有必要从微生物学自身去寻找新的方法。

生长环境

硫酸盐还原菌SRB在地球上分布很广泛，通过多种相互作用发挥诸多潜力，尤其在微生物的代谢等活动造成的缺氧的水陆环境之中发挥作用，如土壤、海水、河水地下管道以及油气井、淹水稻田土壤、河流和湖泊沉积物、沼泥等富含有机质和硫酸盐的厌氧生境和某些极端环境。

SRB在厌氧环境和水环境中分布广泛，可通过硫化亚铁沉淀反应检测到SRB的存在。海洋和沉积物是SRB的典型生境，这些环境中有较高的硫酸盐浓度。在受污染的环境，如腐败食物和污水处理厂排放物中均能检测到SRB的存在，人们还从稻田、瘤胃、白蚁肠道、人畜粪便及油田水中检测到SRB的存在。

分类情况

据不完全统计，SRB已有12个属40多个种，SRB的分类学研究进展比较缓慢。已知的SRB从生理学上分为两大亚类。

Ⅰ类

如脱硫弧菌属、脱硫单胞菌属、脱硫叶菌属和脱硫肠状菌属，其特点是可利用乳酸、丙酮酸、乙醇或某些脂肪酸为碳源及能源，将硫酸盐还原为硫化氢。

Ⅱ类

如脱硫菌属、脱硫球菌属、脱硫八叠球菌属和脱硫线菌属，它们的特别之处是可以氧化脂肪酸，并将硫酸盐还原为硫。随着研究的进展，陆续又有一些新的种属被命名。

培养条件

虽然从理论上讲，SRB为严格的厌氧菌，但随着研究的深入，已有研究结果表明SRB并非严格意义上的绝对厌氧，而是兼性厌氧。

但总体上来说，SRB对氧还是极其敏感的，因此对其培养与分离关键要采用严格的厌氧技术培养SRB不仅仅要求周围生长的环境是无氧的，还有培养基中氧化还原电位必须在-100mV以下。

所以通常在培养基中加入一些强还原剂，如巯基乙醇、抗坏血酸、L2半胱氨酸盐酸盐，这些物质受热容易分解，所以要采用过滤除菌的方法单独灭菌。

温度

⑴中温型：30-40℃之间；

⑵高温型：55-60℃之间。

PH值

5-10内均能生存，最佳pH值在7-8之间。

判断生成标志

是在加有二价铁盐的培养基中，液体培养基表现为全部变黑；而固体培养基在有二价铁盐的存在下则有黑色的菌落生成。

培养方法

液体培养法

液体培养SRB，首先排除培养基内的空气，可以采用高纯氮气吹脱培养基内的空气以及使培养基加热的方法，然后接入适量菌液，在适宜的温度下静置培养。若在培养基上方覆盖一层灭过菌的液体石蜡效果更佳。

固体培养法

⑴稀释摇管法

稀释摇管法是稀释倒平板法的一种变通形式，先将一系列盛有无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化并保持在50℃左右，将已稀释成不同梯度的菌液加入到这些已熔化好的琼脂试管中，迅速充分混匀。待凝后,在琼脂柱表面倒一层灭菌的液体石蜡和固体石蜡的混合物，使培养基尽量隔绝空气。培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。

困难之处在于菌落的挑取，首先需用一只灭菌针将覆盖的石蜡盖取出，然后再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，放在培养皿中，最后用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察并转移菌落。

该法的不足之处是观察与挑取菌落比较困难，但在缺乏专业设备的条件下，此法仍是一种方便有效地进行厌氧微生物分离、纯化和培养的低成该方法。

⑵叠皿夹层法

叠皿夹层法实质是将菌夹在上下两层培养基之间，使其造成一个相对无氧的环境，从而使SRB能在夹缝中生长。

具体做法是将已经富集好的菌液采用无菌操作技术稀释成不同浓度。将含有质量分数为2%琼脂的固体培养基熔化并保持在50℃左右，在无菌条件下，向培养皿（90mm×15mm）的皿盖中倒入约1/3高度的固体培养基，待其刚刚冷凝后，将不同浓度的稀释液吸取适量，快速涂布平板上，使稀释液渗透约30s后，在培养皿的中间位置倒入同种营养型固体培养基，直到将溢未溢的突起状态，随后迅速盖上皿盖并往下压，最终皿内不能有气泡。

去掉培养皿内外两层侧壁间多余的琼脂，并在其中灌入适量熔化的石蜡，使培养皿侧壁缝隙被石蜡密封，尽量不要留有气泡。培养一周后，在加有二价铁离子的平板中会长出黑色的SRB菌落，在酒精灯旁加热使固体石蜡熔化，由于上下两层培养基凝固时间不同，所以当移去内皿后，用镊子很容易将上层培养基揭起，从而露出下层培养基的菌落。当需要进行菌落挑取时,可以对其进行切块转移，放入液体培养基时捣碎即可。

该方法的优点是培养物均采用涂布或划线生长于营养琼脂夹层中，取菌落时可很方便地做到定点取菌，同时该方法不需要另外创建一个无氧环境，故省时、省力，具备了所有好氧、厌氧分离方法的优点。

⑶Hungate滚管技术

Hungate滚管技术是培养厌氧菌最佳的方法。滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术。国内外很多专门做厌氧培养的实验室大都采用此技术。

Hungate滚管技术是指将适当稀释度的菌液，在无菌无氧条件下接入含有琼脂培养基的厌氧试管中，然后将其在滚管机或冰盘上均匀滚动，使含菌培养基均匀地凝固在试管内壁上。当琼脂绕管壁完全凝固后，琼脂试管即可垂直放置贮存，并可使少量的水分集中在底部，经过几天的培养后，就可见到厌氧管内固体培养基内部和表面有菌落出现。挑取菌落时也很方便，可以在酒精灯旁用自制的玻璃细管接种针挑取生长状态良好的菌落，快速接到液体培养基中富集培养。

Hungate滚管技术的优点在于，培养基可以在厌氧管内壁上形成一层均匀透明的薄层，同时菌落可以埋藏在培养基内部或生长在表面，同平板涂布法相比，与氧气接触的机会大大减少。

在地球化学循环中的作用

化石燃料的燃烧、火山爆发和微生物的分解作用是SO2的主要来源。在自然状态下，大气中的SO2，一部分被绿色植物吸收；一部分则与大气中的水结合，形成H2SO4，随降水落入土壤或水体中，以硫酸盐的形式被植物的根系吸收，转变成蛋白质等有机物，进而被各级消费者所利用，动植物的遗体被微生物分解后，又能将硫元素释放到土壤或大气中，这样就形成一个完整的循环回路。微生物在硫元素循环过程中发挥了重要作用，主要包括脱硫作用、硫化作用和反硫化作用。

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