离心技术

生物学技术方法

离心技术，是蛋白质、酶、核酸及细胞亚组分分离的最常用的方法之一，也是生化实验室中常用的分离、纯化或澄清的方法。尤其是超速冷冻离心已经成为研究生物大分子实验室中的常用技术方法。

概况

离心技术是利用物体高速旋转时产生强大的离心力，使置于旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离之目的。这里的悬浮颗粒往往是指制成悬浮状态的细胞、细胞器、病毒和生物大分子等。离心机转子高速旋转时，当悬浮颗粒密度大于周围介质密度时，颗粒离开轴心方向移动，发生沉降；如果颗粒密度低于周围介质的密度时，则颗粒朝向轴心方向移动而发生漂浮。常用的离心机有多种类型，一般低速离心机的最高转速不超过6000rpm，高速离心机在25000rpm以下，超速离心机的最高速度达30000rpm以上。

技术介绍

离心分离是通过离心机的高速运转，使离心加速度超过重力加速度的成百上千倍，而使沉降速度增加，以加速药液中杂质沉淀并除去的一种方法。其原理是利用混合液密度差来分离料液，比较适合于分离含难于沉降过滤的细微粒或絮状物的悬浮液。离心机是一种利用电机高速旋转产生离心力场，根据不同物质之间密度、形状、大小等方面的差异，对悬浮液中混合的不同颗粒或乳浊液中密度不同且互不相溶的液体进行分离和提取的仪器设备，广泛应用于生物学、医学、化工等领域。利用离心机对样品进行分离、纯化和提取的技术称为离心分离技术。常用的离心技术包括：沉淀离心、差速离心、密度梯度离心、分析超速离心、离心淘洗、区带离心及连续流离心等技术，其中沉淀离心、差速离心和密度梯度离心是实验室中常用的离心技术。其余技术均需要特殊的离心机或转头。

差速离心法

差速离心是根据颗粒大小和密度不同造成沉降速度(即沉降系数)的差异，通过分级提高离心转速或高速与低速离心交替进行，使具有不同质量的颗粒样品(或大分子)从混合液中分批沉降至管底，从而实现分离目的。该方法适用于混合样品中各沉降系数差别较大的组分之间的分离，更准确地说是沉降系数差别在1至几个数量级的混合样品的分离，差别越大，分离效果越好。

差速离心法一般采用固定角转子，通过较低速度的离心沉淀，最重的颗粒将全部沉到管底。继续将上清液以更高的转速沉淀，即可得到次重的颗粒样品。逐步增加离心转速，即可分别得到不同重量的样品颗粒，以达到分离的目的。但以上只是理想状态，通常每步得到的沉淀并不均一，通常会混有较轻的颗粒。这是因为在离心前各种重量的颗粒均匀分布在溶液中，当开始离心后，所有颗粒都依照自身的沉降速度向管底移动，所以距离管底较近的轻颗粒也会沉到管底而混合到重颗粒之中。通常为了得到较纯的颗粒样品，还需要将沉淀重悬，用相同的转速再次沉淀。重复几次之后即可得到大小基本均一的颗粒。但是一般在实际使用中，差速离心通常不用于精细分离。仅用于s值相差1个数量级及以上的2种颗粒的分离，且沉淀不能实现完全回收。

差速离心技术的应用十分普遍，尤其是针对有生物活性的物质，如动植物病毒、各种亚细胞组分(细胞核、叶绿体、线粒体等)，以及核酸和蛋白质等生物大分子的分离、粗提和浓缩。

梯度离心法

密度梯度离心法是使待分离样品在密度梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，最终分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法，又称区带离心。密度梯度离心不仅可依据样品颗粒的重量及沉降系数进行分离，还可根据样品颗粒的密度、形状等特征进行分离。密度梯度离心在整个离心过程中只使用一种转速，中途无需变更实验参数，而差速离心则需要进行调整转速、重悬反复离心等操作。密度梯度离心适宜分离密度有一定差异的样品，而差速离心则适用于分离混合样品中各沉降系数差别较大的组分。

密度梯度离心的优点是：分离效果好，可一次性获得较纯的样品颗粒；适应范围广，既可像差速离心法一样分离具有沉降系数差异的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；颗粒会悬浮在相应的位置上形成区带，而不会形成沉淀被挤压变形，故能最大限度保持样品的生物活性；样品处理量大，且可同时处理多个样品；对温度变化及加减速引起的扰动不敏感。密度梯度离心法的缺点是：离心时间长、需制备密度梯度介质溶液、对操作者的技能要求较高。密度梯度离心法通常采用吊桶式的水平转子、区带转子及近垂直转子。

离心前，离心管内先装入分离介质（如蔗糖、甘油等），使形成连续的或不连续的密度梯度介质，然后加入样品进行离心，具体又可分为：

速度区带

离心前，离心管内先装入蔗糖、甘油、CsCl、Percoll等密度梯度介质，待分离样品铺在梯度液的顶部，离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心，利用各颗粒在梯度液中沉降速度或漂浮速度的不同，使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。本法可分离各种细胞、病毒、染色体、脂蛋白、DNA和RNA等生物样品。

预制梯度

要求在离心前预先配制管底浓而管顶稀的密度梯度介质，常用介质有蔗糖、CsCl、Cs2SO4等，待分离样品一般铺在梯度液顶上，如需挟在梯度液中间或管底部，则需调节样品液密度。离心后，不同密度的样品颗粒到达与自身密度相等的梯度层，即达到等密度的位置而获得分离。

自成梯度

某些密度介质经过离心后会自成梯度，例Percoll，可迅速形成梯度，CsCl、Cs2SO4和三碘甲酰葡萄糖胺经长时间离心后也可产生稳定的梯度。需要离心分离的样品可和梯度介质先均匀混合，离心开始后，梯度介质由于离心力的作用逐渐形成管底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时，可以带动原来混合的样品颗粒也发生重新分布，到达与其自身密度相等的梯度层里，即达到等密度的位置而获得分离。

沉降平衡

根据被分离物质的浮力密度差别进行分离，所用的介质起始密度约等于被分离物质的密度，介质在离心过程中形成密度梯度，被分离物质沉降或上浮到达与之密度相等的介质区域中停留并形成区带。

离心工具

离心机(centrifuge)是实施离心技术的装置。离心机的种类很多，按照使用目的，可两类，即制备型离心机和分析型离心机。前者主要用于分离生物材料，每次分离样品的容量比较大，后者则主要用于研究纯品大分子物质，包括某些颗粒体如核蛋白体等物质的性质，每次分析的样品容量很小，根据待测物质在离心场中的行为(可用离心机中的光学系统连续地监测)，能推断其纯度、形状和相对分子质量等性质。两类离心机由于用途不同，故其主要结构也有差异。通常所使用的离心机根据转子转速大小的不同可分为普通离心机、高速离心机和超速离心机三类。

技术原理

介绍

将样品放入离心机转头的离心管内，离心机驱动时，样品液就随离心管做匀速圆周运动，于是就产生了一向外的离心力。由于不同颗粒的质量、密度、大小及形状等彼此各不相同，在同一固定大小的离心场中沉降速度也就不相同，由此便可以得到相互间的分离。

离心力

溶液中的固相颗粒做圆周运动时产生一个向外离心力，其定义为：

F = mω2r

式中：

F 为离心力的强度； m 为沉降颗粒的有效质量；

ω 为离心转子转动的角速度，其单位为rad/s；

r 为离心半径(cm)，即转子中心轴到沉降颗粒之间的距离。

很显然，离心力随着转速和颗粒质量的提高而加大，而随着离心半径的减小而降低。离心力通常以相对离心力Fcf 表示，即离心力F 的大小相对于地球引力(G)的多少倍，单位为g，其计算公式如下：

Fcf = 1.119×105(h)2r×g

可以看出，在同一转速下，由于f 的不同，Fcf相差会很大，实际应用时一般取平均值。在离心实验的报告中，Fcf、r 平均、离心时间t 和液相介质等条件都应表示出来，因为它们都与样品的沉降速度有直接的联系。显然Fcf是一个只与离心机相关的参数，而与样品并无直接的关系。

速度与系数

一个颗粒要沉降，它必须置换出位于它下方等体积的溶液，这只有当颗粒的质量大于被置换出的液体的质量时才能通过离心的手段达到，否则，在离心过程中颗粒将发生向上漂浮，而不是下沉。当颗粒在运动时，不论方向如何，它都要穿过溶剂分子，所产生的摩擦力总是与颗粒运动的方向相反。

摩擦力的大小与颗粒的运动速度成正比，并且受颗粒的大小、形状及介质性质的影响：式中：

f 为颗粒在济剂中的摩擦系数．与颗粒的大小、形状及介质性质相关；

v 为颗粒的沉降速度。

由于离心力的存在，颗粒将加速运动直到摩擦力与离心力相等。在这种情况下，颗粒所受到的净作用力为零，颗粒将以最大速度运动。

式中 Mp 和M s 分别为颗粒的质量及等体积的溶剂的质量。

上式中的Mp 和M s 很难确定，为了建立分子大小与沉降系数之间的关系，引入了沉降系数这一新的概念。沉降系数定义为沉降速度与离心力的比率或单位离心场中颗粒的沉降速度，它以svedberg单位计算，1S=1×10-13 s。例如，核糖核酸酶A 的沉降系数为1．85×10-13 s，即可记作1．85S。

近年来，在生物化学、分子生物学及生物工程等书刊文献中，对于某些大分子化合物，当它们的详细结构和分子量不很清楚时，常常用沉降系数这个概念去描述它们的大小。如核糖体RNA(rRNA)有30 s 亚基和50s 亚基，这里的s 就是沉降系数，现在多地用于生物大分子的分类，特别是核酸。

类型

最大速度方法

(1)移动界面超速离心法

含几个组分的样品在足够高的离心场中离心时，每种颗粒都达到其最大沉降速度，这时样品开始分离。离心管的上层逐渐形成透明的上清液，并形成对应于样品各组分的一系列浓度界面，界面的移动相对于每种组分来说是特征的。

虽然利用这种方法不一定能实现组分的纯化分离，但可以通过监测界面的移动来测定各组分的沉降速度。要想实现组分间的分离，必须在所需样品沉降之后停止离心过程。沉积的样品再悬浮到新的溶剂中，并以较低的速度离心使大颗粒的污染物沉降，而被纯化的样品留在溶液中，经过反复多次地离心才能得到纯的样品，这种方法就叫差示沉降离心法，它对细胞组分间的分离非常有用。也可以通过逐渐增大转速的方法实现不同组分间的分离。

(2)移动区带超速离心法

差示离心法离心前各组分均匀分布在整个溶液中，所以分离一般不理想，而移动区带超速离心法是一种密度梯度(Dens 心Gradient)离心技术，在离心之前离心管中溶液的密度不同(从上到下密度增大)，梯度介质中最大密度应小于样品物质的最小密度，其特点是物质的分离取决于样品物质颗粒的质量．即样品物质的沉降系数，而不是取决于样品物质的密度，因而适合于分离密度相近而大小和形状不同的物质，这属于一种非平衡态分离法。当样品物质轻轻地铺在密度梯度介质的液面上，起动离心机，在离心力的作用下，一定时间后便形成不同物质的区带。当继续离心时每个区带会逐一达到管底，所以，在沉降最快的区带到达管底之前要停止离心，并将每个区带分部收集。最常用的制备密度梯度的化合物有蔗糖、甘油、氯化铯和硫酸铯等。

等密度方法

等密度离心法也叫沉降平衡法。所谓等密度是指样品密度与介质的密度相等，实际上是在梯度密度介质中进行的。该技术的特点是沉降分离与样品物质的大小和形状无关，而取决于样品物质的密度。这种方法非常类似于电泳中的PH 梯度等电聚焦方法，在离心时，颗粒依其密度的不同沉降或向上漂浮，直到移动到与自身的密度相同的溶剂梯度中为止，其结果是依样品物质密度的不同在梯度溶剂中形成一个个区带。

在实验方法上可以采用预先制备密度梯度溶液的方法，一般先制备两种储备液，它们的浓度决定最终所形成梯度溶液的极限。可以通过分步减小密度，从离心管底部到上部逐渐加液的方式形成不连续梯度溶液，也可以通过一个梯度混合器产生连续梯度密度。储备液一般使用两种密度的蔗糖溶液或两种密度的氯化铯溶液来制备。样品一般铺在溶液的表面，然后开始离心。

在实验方法上也可以采用平衡密度梯度法，在这种离心法中，介质的梯度不是预先配制，而是在离心过程中，由于离心力的作用而逐渐形成。样品物质和氯化铯的浓盐溶液充分混合均匀，离心开始之后，铯盐由于离心力的作用，自离心管口至离心管底形成连续递增的密度梯度。生物样品中不同组分物质在离心过程中沉降或上浮以寻找与自身密度相同的溶液密度梯度区带，不同的物质最终到达相应的区带，从而实现分离。这种方法依赖于在离心场的作用下低分子量的铯盐密度梯度的形成，一般需要长时间的离心(2~3天)。显然，样品物质的密度应介于介质梯度中最大和最小密度之间，否则，样品将沉到离心管的底部或漂浮到溶液的顶层。

实现方法

穿刺法

这是方便而又理想的部分收集方法。用一根金属空心针从离心管底刺人管内，不同区带内的组分自下而上地先后从针管内分别流出，然后用部分收集器分别收集。

取代法

在离心管口加一个带有收集导管的塞子，塞子上同时装有一根输液导管插入离心管的管底，从输液管中注入高密度的离心介质．其密度高于离心管中所形成的最大密度。当取代液不断注入时离心管中的溶液逐渐上升，并不断从收集导管中流出，然后用部分收集器分别收集。

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