细胞固定化培养

将植物悬浮细胞包埋在多糖或多聚化合物网状支持物中进行无菌培养的技术

细胞固定化培养技术是将植物悬浮细胞包埋在多糖或多聚化合物(如聚丙烯)网状支持物中进行无菌培养的技术。由于细胞处于静止状态，促使细胞以多细胞状态或局部组织状态一起生长，所建立的物理和化学因子就能对细胞提供一种最接近细胞体内环境的环境。固定化是植物细胞培养方法中一种最为接近自然状态的培养方法。

定义

经过植物组织培养研究者的努力，已有多种植物细胞培养物已进人中试阶段和实现了工业化生产。当然植物细胞培养也存在一些问题，例如，培养中的细胞遗传和生理的高度不稳定性，目标物的产量低，放大培养困难，植物细胞的生长速度慢等，使得作为商业目的的植物细胞培养成本过高，为此寻找一条把植物细胞固定化作为次生代谢物生产的生物催化剂的新途径是很有必要的。与液体悬浮培养相比，固定化培养具有较多优点：①固相细胞接触紧密，生长缓慢，细胞拟组织化，从而有利于次生物的积累。②细胞包埋在聚合物中得到保护，可以减少剪切力的损伤作用。③固相培养更有利连续培养及生物转化过程的实现。④高密度的细胞群体，可建立细胞间的物理、化学联系，细胞位置的相对固定，有利于物化梯度的建立，更有利于产物的合成。⑤环境条件易于控制，次生代谢物易于释放。

特点

(1)固定化培养的细胞生长缓慢

当细胞被固定在一种惰性基质上面或里面时，与在悬浮液培养基中的细胞相比，细胞以较慢的速度生长并产生较多的次生代谢产物。有证据表明，细胞生长速度和次生代谢物积累之间存在着负相关性，因此，固定化细胞的缓慢生长有利于次生代谢物的高产。

(2)细胞的组织化水平高

人工聚集(固定化)不仅使培养细胞的生长速度减慢，而且细胞与细胞之间的紧密接触提高了细胞的组织化水平，使其越接近于整体植株的水平，从而使培养细胞以与整体植株相同的方式对环境因子的刺激起反应，这更有利于次生代谢物的产生和积累。如Lindsey发现，在生物碱的积累能力上，聚集的或部分组织化的细胞要比生长迅速而松散的细胞高。

(3)易于次生代谢物的收集

植物细胞固定化培养体系大多是一个连续的生产体系，很容易使所要的代谢物从细胞运送到周围的介质里，并能很容易地将此化合物从营养介质里分离出来，而且固定化细胞培养体系使得在收集产物时对细胞不产生伤害。此外，在固定细胞上用化学处理来诱导产物的释放是相当容易进行的，这可以应用到在那些天然情况下不向外释放产物的细胞上。这一点对把次生代谢物的产量提高到最大限度是很重要的，因为它消除了反馈抑制作用。

优点

经过多年的研究发现，与悬浮培养相比，固定化培养具有很多优点：①提高了次生物质的合成、积累；②能长时间保持细胞活力；③可以反复使用；④抗剪切能力强；⑤耐受有毒前体的浓度高；⑥遗传性状较稳定；⑦后处理难度小等特点。又发现了固定化培养的新优点：①一般情况下，由于在固定化细胞团中形成了光密度梯度，内部的细胞有了较好的生长，所以固定化有助于植物细胞的光合作用。Kurata等用海藻钙凝胶固定阿拉伯咖啡细胞，发现生物碱产量与光密度的变化一致，而且细胞的生长不被高的光密度抑制。②在固定化培养中，产物和对细胞生长有抑制作用的代谢物可被培养基带走；这样，一方面有利于产物的生成，另一方面也防止了已生成产物的进一步降解转化。实验证明烟草细胞的固定化促进了其产物酚醛塑料(phenolics)的释放。同时还发现包埋的烟草细胞和Solarium aviculare，能够将在悬浮培养时不释放的异东莨菪苷(scopolin)释放到培养基中。

缺点

当然，固定化细胞也存在一些缺点，主要表现为：①必须保持菌体的完整，防止菌体的自溶，否则会影响产物的纯度；②必须抑制细胞内蛋白酶的分解作用；③由于细胞内有多种酶存在，往往有副产物形成，为防止副产物必须抑制其他酶活力；④细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍。

固定方法

细胞固定化培养技术主要利用包埋法来固定植物细胞，将植物细胞固定在各种不同的凝胶、薄膜以及多聚物的网孔内。海藻酸钙由于其毒性相对低，操作简单，是使用最多的包埋基质。除此之外，其他的胶类如琼脂、琼脂糖、凝胶、角叉藻胶和聚丙烯酰胺等也被使用。其他的包埋物如聚氨酯泡沫和中空纤维膜也可选用。用包埋法固定植物细胞，方法比较简单，活性回收率比较高，固定化的植物细胞活性保持时间也较长。

此外，植物细胞常用的固定化方法还有聚氨基甲酸乙酯泡沫自然吸附法、自然的自固定化方法以及共价交联法等。

细胞固定化培养技术按照其支持物不同可以分为两大类：包埋式固定化培养系统，支持物多采用琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺等；附着式固定化培养系统．支持物采用尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维等材料。

常用细胞反应器

植物细胞固定化培养常用的细胞反应器有以下两种。

(1)平床培养系统本系统由培养、液罐和动泵等构成。新鲜的细胞被固定在床底部由聚丙烯等材料编织成的无菌平垫上。无菌液罐被紧固在培养床的上方，通过管道向下滴注培养液。培养床上的营养液再通过动泵循环送回。本系统设备较简单，比悬浮培养体系能更有效地合成次生物质。不过它占地面积大，累积次生代谢物较多的滴液区所占比例不高；而且在这密封的体系中氧气的供应时常成为限制因子，经常还得附加提供无菌空气的设备。

(2)立柱培养系统本方法将植物细胞与琼脂或褐藻酸钠混合，制成一个个1～2 cm3的细胞团块，并将它们集中于无菌立柱中。这样，下滴的营养液流经大部分细胞，亦即“滴液区”比例大大提高，次生物质的合成大为增强，同时占地面积大为减小。

这一技术的优点在于：细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成；由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用；正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物．因此，它可以进行连续生产。可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节。

注意事项

植物细胞固定化培养时必须考虑以下几个问题：

(1)所选用的植物细胞的次生代谢产物的产量是否很高，细胞生长速度是否较慢并能维持较长时间的生活能力；

(2)所选用的固定支持物对细胞的存活是否有影响，对产物的合成是否有阻碍；

(3)终产物是否能释放到培养基中，如果产物不释放到培养基中，是否能采用物理(电击)或化学(离子渗透法)方法使其释放而又不影响细胞生活力。

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