绝对计数

按实际检测结果计数

绝对计数是按实际检测结果计数；相对计数是通过实际检测结果与理论值按百分比做的结果。

概念

传统的CD4阳性淋巴细胞的检测方法是通过计数外周血总白细胞和淋巴细胞百分比来计算T淋巴细胞亚群的绝对数。这一方法需用手工或血细胞计数仪来计数总白细胞(W BC)和各分类白细胞，再用流式细胞仪或显微镜得出淋巴细胞亚群百分比，相乘得出 CD4T淋巴细胞的绝对数。这种双平台方法由于多步骤测定方法，得到的结果误差很大，一定程度上限制了其临床应用。

FACSCount系统是BD公司最近研发的一个是专门设计用来自动计数 CD3+，CD3+CD4+(CD4+)，CD3+ CD8+ (CD8+)阳性细胞及 CD4+/CD8+比值的集成细胞计数仪，样本标记步骤简捷，可以直接测量T细胞各亚群细胞的绝对数量而无须计数外周血白细胞和淋巴细胞百分比。相关研究选用另一种单平台计数淋巴细胞各亚群的方法，以FACS M ultiSET系统作为参照系统来比较两个系统得到数据的精确性、重复性以及操作特点等，评价使用 FACSCount系统临床应用的可行性。

计数与分析

研究背景

多发性骨髓瘤（multiple myeloma， MM）是一种B细胞的恶性肿瘤，中老年人常见，以骨髓中积聚大量的恶性浆细胞并分泌单克隆免疫球蛋白为特征。骨髓瘤的临床表现较复杂，而且影响预后的因素也很多，生存期从数月到数十年不等。传统的预后指标包括年龄、浆细胞指数、β2-微球蛋白（β2-MG）、分子细胞遗传学等。有文献报道外周血淋巴细胞绝对计数（absolute lymphocyte count，ALC）也成为恶性血液病的预后因素之一。

同时有研究证实初发时ALC较低的弥漫性大B细胞淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤患者的生存期较短，预后较差，但是国内外关于ALC与MM预后的相关性研究较少。因此对102例初发的MM患者进行回顾性分析，分析ALC与患者各项临床特征和其他预后因素的相关性，推测ALC作为MM预后指标的可行性及临床应用价值。

材料与方法

（1）方法

回顾性分析了102例骨髓瘤患者，查阅并记录患者年龄、性别、ALC、乳酸脱氢酶（LDH）、白蛋白（ALB）、β2-MG、肌酐（Cr）及其总生存期（overall sur⁃vival，OS）以相应ALC的中位数分组，后统计ALC与

其他各项临床指标的相关性。随访截止日期为2012年2月29日。总生存时间的计算为疾病确诊时间至死亡或末次随访的时间段。所有失访患者均计算至末次随访日止，按截尾数据处理。随访方法采用电话随访。

（2）统计分析

采用SPSS10.5统计软件包进行统计分析。组间计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验。对生存概率的估计采用Kaplan-Meier法，并用Log-rank法对结果进行显著性检验。P<0.05为差异有统计学意义。

讨论

机体的免疫状态和恶性血液病的转归与预后有很大关系，ALC代表患者的免疫状态，也是影响其预后的因素之一。有文献报道ALC不仅可预测非霍奇金淋巴瘤预后，对霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、急性白血病、卵巢癌、转移性乳腺癌、进展期软组织肉瘤等也具有预后价值。ALC减少与不良预后之间的关系机制尚不清楚，可能与ALC减少与机体免疫抑制相关，反映机体免疫功能低下；淋巴瘤细胞分泌的细胞因子对淋巴细胞具有毒性溶解作用，导致ALC减少。上述两种因素共同存在，也可能存在其他未知因素。Brown等的研究发现，MM患者体内有

着免疫系统的多种缺陷，而且免疫功能的缺陷作为该病的一个重要特征影响着疾病的进程，只是具体免疫功能缺陷的分子机制尚不明确。

有研究报道，淋巴瘤患者自体造血干细胞移植后ALC>0.5×109/L的患者中位OS及疾病无进展生存率（PFS）明显高于ALC<0.5×109/L的患者。Ege等发现MM患者ALC<1.4×109/L，OS较短。本研究发现初发时ALC>1.51× 109/L 的患者中位OS明显高于ALC<1.51×109/L的患者，与文献基本一致。说明ALC对MM预后的判断有一定的帮助性。

Bradwell等研究证实血清游离轻链和β2-MG与MM预后相关。同时有文献报道血清LDH越高，肿瘤恶性程度越高，预后也越差。Palumbo等研究发现，患者的年龄对于个性化治疗有重要影响，患者年龄>75岁是其预后不良的影响因素之一，年龄越大，预后越差。Barlogie等的研究发现高LDH和血钙水平等指标影响了MM患者的早期生存，而年龄和β2-MG可影响长期生存。还有文献显示LDH水平是MM的一项独立预后指标，可以作为评估疾病进

展及预后状态的重要指标。本组实验的统计结果显示，初发时高水平 ALC 的 MM 患者发病年龄、血清LDH及β2-MG均低于低水平 ALC的患者，由此可以推测 ALC 与其他预后指标结合，对于患者的预后有重要意义。

近年来预测 MM的预后变得更加复杂，与之有关的预后因素的研究也不断涌现。本研究通过分析ALC与患者各项临床指标和总生存期的相关性，ALC较高的患者发病年龄较低，血清LDH值及β2-MG较低，同时总生存期较长。因此可以推测ALC可作为MM独立的预后因素之一。ALC检测简洁方便，费用低，对患者的负担小，便于普及使用于任何类型的医疗机构。同时耗时较短，可以及时为临床医生提供第一手的信息，方便及早干预治疗。由于本研究样本例数有限，未对患者的分子细胞遗传学改变进行随访，因此未找到 ALC与分子细胞遗传学的相关性，

有待增加样本加强随访，进一步分析。

方法

干细胞移植对于白血病等多种疾病的治疗具有重要意义，而准确的干细胞绝对计数对于干细胞移植的成败又十分重要。流式细胞仪结合荧光单抗技术为干细胞绝对计数提供了一种快速、定量、重复性好的方法。

原理

干细胞计数是根据血液中不同血细胞的特性，选择特异性标记物，采用多参数分析的方法，排除细胞之间的干扰，识别出不同的细胞并分类计数。具体而言，针对干细胞核酸含量高、大小与大淋巴细胞相近、粒度与淋巴细胞相似、CD45 表达弱、CD34 表达强的特点，首先可通过核酸染料标记所有的有核细胞(包括白细胞和幼稚的红细胞)，排除细胞碎片及无核细胞；其次通过抗CD45抗体标记所有白细胞，并根据CD45表达强度的不同区分不同的白细胞，从而排除CD45表达强的细胞，避免CD45弱表达细胞的丢失；然后用抗CD34抗体标记CD34阳性表达的细胞，即干细胞。总之，通过核酸量、SSC的强度、CD45和CD34的表达量等多个参数将干细胞与淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、死细胞、细胞碎片、血小板团块以及红细胞区别开来。

同时，样品管中还加有已知数量的三色标记的易于与细胞区分的荧光微球作为绝对计数的内标。根据所采集到的干细胞数与荧光微球数目的比值，再乘以样品管中的荧光微球数，即为样品管中干细胞的数目，再除以样品的体积，即可求得样品中干细胞的浓度。

意义

对于有剂量要求的干细胞移植方案而言，精确的干细胞计数显然十分重要。研究表明，需要输入病人体内的 CD34阳性细胞量取决于病人的体重，每公斤体重应输入2百万至5百万个CD34阳性细胞。此重要性也显示在动员及白细胞分离过程中，如通过计数细胞水平判断动员是否成功、何时为最佳采集时间以及采集到的干细胞数量是否足够等等。由于干细胞所占的比例很小，在外周血中不到0.1%，在骨髓中也只占单个核细胞的1%至4%，因此利用流式细胞仪在大量细胞中快速准确地筛选并测出干细胞的绝对数量对于干细胞移植具有重要意义。

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