耐辐射奇球菌

地球上已知物种中最耐电离辐射的生物之一

耐辐射奇球菌（Deinococcusradiodurans, DR）是一种极端微生物。1956 年由美国科学家Anderson等首次从4kGy电离辐射灭菌后仍然变质的肉类罐头中分离出来，被“吉尼斯世界记录”收录并誉为是“世界上最顽强的细菌”。因该细菌具有极强的DNA修复能力，已成为微生物中DNA损伤修复的理想模式生物。对其研究利用还将为放射性和重金属污染物的生物修复、放疗和抗肿瘤药物的研究以及细胞衰老的研究开辟新途径。

简介

耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans, DR)是地球上已知物种中最耐电离辐射的生物之一。它是1956 年由美国科学家Anderson 等首先从辐照灭菌后仍然发生变质的肉类罐头中分离出来的。该细菌属于极端微生物，对电离辐射、紫外线、干燥、强氧化剂和一些化学诱变剂等各种DNA 损伤介质的致死和突变效应显示惊人的抗性，被誉为“地球上最顽强的细菌”。

形态特性

耐辐射奇球菌的菌落呈圆形，直径约在1~2 μm之间，好氧，能产生粉红色色素，不产孢子。单克隆的菌苔呈凸状，表面光滑，在指数生长期，约90%的细菌呈二联体存在；随着细胞分裂，生长后期形成四叠体；在稳定期，绝大多数细菌呈四叠体。其最适生长温度是30℃，在37℃时生长速度最快。当温度低于4℃或高于45℃时，细胞停止生长。

细胞结构

耐辐射奇球菌有一个不寻常的细胞壁结构，虽然它的细胞壁成分和一般的兰

氏阴性细菌相似，但是由于它的肽聚糖层比较厚，难以脱色，因此实际革兰氏染

色呈阳性。其细胞壁可以划分为一个14-到20-nm 的肽聚糖层和一个未知的分层结构，在电镜下，至少可以分为六层，最里面一层是细胞膜，紧挨着细胞膜是含有肽聚糖的细胞壁，细胞壁上有很多孔，也称为多孔层，壁上的这些孔对细胞有重要的生理学意义。第三层是可以分成无数的细小的区域（分区层），第四层是外膜，第五层是电子致密区；第六层由规则排列的六角形的蛋白亚单位组成(S 层, 或六角排列的中间体层)，也有一些耐辐射奇球菌外面还有一层厚的多糖外膜。但是在细胞分裂时，只有细胞质膜和肽聚糖层参与形成细胞间隔断，其他的各层仅作为外鞘，在分裂的子细胞分离时，包绕在子细胞外面。

细胞外膜和细胞质膜在脂类组成上一样，但没有发现其他菌中普遍存在的脂

多糖。耐辐射球细胞壁的脂肪酸组成也是与众不同，它既不含有羟基脂肪酸、类

脂A 以及庚糖，也不含有多不饱和脂肪酸、环丙基和分支脂肪酸，而含有一个

由15-, 16-, 17-, 以及18-碳饱和或单不饱和脂肪酸组成的混合物。和其他细菌另一个明显的不同是缺乏磷脂，耐辐射球细胞膜的脂类中，43%是含有烷基胺的磷酸甘油酯。

基因组结构

耐辐射奇球菌为多基因组，稳定生长期细胞中至少含有4 个拷贝的基因组，而在分裂旺盛的指数生长期则可达10 个以上拷贝。冗余的基因组拷贝数给细胞提供了一个遗传信息储蓄库，使其通过同源重组修复DNA 双链断裂更有优势。Levin-Zaidman等描述了在耐辐射奇球菌类核中的一个不同寻常的环状结构。高度浓缩的类核结构对辐射抗性有贡献，因为这种结构使得耐辐射奇球菌在产生DSB 后也能维持DNA 线状连续性。基因组构象与DNA修复的关系显然很重要，然而Zimmerman 等人和本实验室的研究结果则认为类核环形结构对耐辐射奇球菌的电离辐射抗性并不是必须的。

1999 年，White 等在Science 上公布了耐辐射奇球菌野生型菌株R1 的全基因组序列。整个基因组由4 个环状分子组成，包括两条染色体(染色体I 为2.65 Mb、染色体II 为412 kb) 、一个巨型质粒(177 kb) 和一个小质粒(45. 7 kb)，总共3284156bp，平均G+C 含量66.6%。整个基因组编码3187 个开放阅读框(Open reading frames，ORFs)，平均大小约937 bp，覆盖了整个基因组的91%。其中约1/3的基因不能从现有数据库中找到同源物（1002 个）或是功能未知的（511 个）和复制有关的基因主要位于染色体I 和II。

DNA损伤抗性

耐辐射奇球菌是最具辐射抗性的生物体之一。指数生长期的耐辐射奇球菌对γ-射线表现出极强的抗性，存活的最高剂量是15 kGy（若在生长后期，则它们的存活率更高些，可达到17 kGy），是人体细胞耐受力的3000倍，且没有任何产生突变的证据。在8kGy 的电离辐射下，耐辐射奇球菌仍保持10%的存活率，而大肠杆菌在0.15 kGy照射剂量下才能达到10 %的存活率。另外，指数生长期的耐辐射奇球菌在在5kGy的电离辐射下，对数生长期的耐辐射奇球菌细胞不受任何影响；其D37（存活率为37 %时的辐射剂量）为6.5 kGy左右，而在该电离辐射剂量下大肠杆菌（E. coli）和枯草杆菌（Bacillus spp.）都不能生长。

在紫外线抗性上，耐辐射奇球菌可以在高达1000J/m的UV处理后存活下来，在500J/m2的剂量下，它的生存没有影响，而大肠杆菌的存活则急剧下降。对数生长期的耐辐射奇球菌的UV抗性大约是大肠杆菌的33倍左右。

耐辐射奇球菌具有很强的抗干燥能力，在一个干燥器内存放六年后，仍能保

10%的存活率。科学家研究证明了耐辐射奇球菌的辐射抗性和干燥抗性的关系。他们将野生型和41株对辐射敏感的耐辐射奇球菌同时放在干燥器内，六周后检测他们的存活率，结果表明对辐射敏感的菌株对干燥同样敏感。表明耐辐射奇球菌抗干燥机制和抗辐射机制有关。

耐辐射奇球菌经大剂量γ-射线照射（15 kGy）后染色体基因组产生约150～200 个双链断裂（Double-strand break, DSB）的DNA 片段，约3000 个单链片段(SSBs)和至少1000 个损伤的碱基位点。其中DSB 是DNA 损伤中最致死的形式。尽管所有生物都具有DNA 修复机制，但在多数物种中只有很少一部分DSB 能被修复。DNA 脉冲场凝胶电泳实验表明，电离辐照后耐辐射奇球菌染色体基因组由原来的2.65×10 kb 泳带变为50 kb 或更小的一条带，这些产物对一般细胞都是致命的，而受损伤的耐辐射奇球菌基因组却能在几十小时之内完全修复。

极端抗性机制

耐辐射奇球菌对辐射、干燥、化学试剂毒性等极端环境有明显的耐受性，归因于其在细胞结构，遗传信息，代谢调节，损伤修复等方面形成了一套完善的抗性机制。

▪耐辐射奇球菌的自我保护

在结构上，耐辐射奇球菌细胞拥有多方面的保护，如外面有一层较厚的细胞壁，细胞膜内含有大量的类胡萝卜素。另外，基因组内编码多种清除活性氧的蛋白，包括三种过氧化氢酶，至少三种超氧化物歧化酶和过氧化物酶，有利于防范因电离辐射，UV 、强氧化剂和干燥等造成的活性氧损伤细胞。如电离辐射的间接作用能在细胞内产生大量的自由基，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)能有效清除细胞内超氧阴电离自由基(Oˉ)、径自由基(·OH)和过氧化氢(H2O2)等对细胞毒害作用极强的活性氧自由基。生物体内的SOD、CAT 和POD 3 种酶活性的高低和所含的其他保护物质的量，在一定程度上也决定着对辐射抗性的强弱。在正常条件下，耐辐射奇球菌细胞中SOD 的活性比对照大肠杆菌高出6 倍，用Mn处理稳定期的细胞，其SOD 的活性又比未处理的高出3倍。耐辐射奇球菌细胞中CAT 的活性更是比对照的大肠杆菌高出30 多倍。耐辐射奇球菌的SOD、CAT 和POD 等保护酶的高含量成了其辐射抗性极强的一个原因。

耐辐射奇球菌菌体内大量合成以deinoxanthin为主要产物的类胡萝卜素类胡萝卜素。Deinoxanthin具有特殊结构，该色素由一个六元环和一条长不饱和碳链组成，环上含有一个羟基（2-OH）和酮基（4=O），长链末端尾部还具有一个羟基（1′-OH），其结构与现在已知的主要色素种类如番茄红素（lycopene）和β-胡萝卜素（β-carotene）等均存在明显差异，自由基清除能力比同类色素均要强很多，因此认为该特殊类胡萝卜素作为高效的抗氧化剂，参与了菌体内抗氧化体系，对该菌的极端抗性机制具有重要贡献。

▪冗余的遗传信息

耐辐射奇球菌细胞内有多个基因组拷贝，一般在稳定期的细胞内有4个拷贝的染色体，而活化的细胞内则有4-10条染色体。多拷贝的基因组提供了冗余的遗传信息，有利于减少因辐射造成的遗传信息丢失，从而有利于DNA修复，使其在抗逆性中扮演重要角色。

▪染色体间重组

经过5kGy剂量辐照处理后，耐辐射奇球菌的每个染色体上可产生150个左右的DNA双链断裂。细胞内的核酸外切酶可以作用于DNA断裂处，迅速破坏DNA末端，造成序列信息的丢失。尽管如此，耐辐射奇球菌还是有能力将这些碎片重新组合成完整的染色体。断裂是随机产生的，由此在每条染色体上造成的遗传信息缺失也是随机的，因此尽管每一条染色体都有断裂，但是不同染色体间断裂的分布是不同的，如果细胞可以介导染色体间碎片重排的话，理论上，碎片是足够修复形成一个完整的染色体。实验证明在耐辐射奇球菌的四条染色体间，辐照可以诱导产生600多个交联，其中大约有三分之一是单向的，说明耐辐射奇球菌可能是通过将染色体片段连接到一起来重建其完整染色体。

▪DNA修复的有序调节

在真核细胞中，DNA损伤可以抑制细胞的DNA复制。在原核细胞中，只有当DNA损伤阻碍了沿着模板移动的DNA聚合酶时， DNA复制才会停止。然而在耐辐射奇球菌中，也存在着辐射诱导的DNA复制抑制现象。实验证明在耐辐射奇球菌染色体中，损伤引起的复制暂停时间和剂量相关，并且停顿的时间总是超过修复引起停顿的DNA损伤时间，表明耐辐射奇球菌的DNA复制对细胞内的DNA损伤是很敏感的，细胞内有一套检测DNA损伤修复程度的机制发挥作用，并可给复制系统传导修复的信息。也就是说耐辐射奇球菌内有一套类似真核生物的可调节的检测点，可以控制DNA复制以及后面的细胞分裂。研究人员从遗传学上进一步证明了耐辐射奇球菌DNA损伤检测点的存在，他们鉴定了耐辐射奇球菌突变体SLR2、SLR4和SLR5，这些突变体的辐射抗性没有改变，倍增时间也和野生一样长，不影响生长，但是辐照后恢复明显变慢，形成菌落需要更长的时间。

▪DNA降解

电离辐照后，耐辐射奇球菌中迅速发生广泛的染色体DNA 降解。这种降解可能是由细胞内的DNA 单链或双链断裂引起的。对大多数物种来说，伴随着DNA 降解造成的遗传信息丢失是辐射诱导死亡的一个重要原因。然而，研究表明耐辐射奇球菌的DNA 降解是其修复的一部分，降解的过程和辐照剂量相关，剂量越大，降解持续的时间越长，染色体DNA 的损失也就越多。DNA 降解速率与剂量无关，每分钟大约有0.1%的染色体被降解。耐辐射奇球菌限制DNA 降解的程度是细胞对电离辐射致死效应的一种保护。

▪损伤DNA的外排

染色体DNA降解伴随着损伤DNA片段由细胞内向细胞外的排出。DNA损伤早期，在耐辐射奇球菌的细胞质及培养液中均发现DNA损伤片段，初期降解产物是寡核苷酸，长约2 kb碱基对，随后降解为核苷，可快速地从细胞中排出。这一阶段被认为是耐辐射奇球菌DNA损伤修复的第一阶段，称“细胞清除期”。游离核苷酸输出的程度与辐照的剂量呈正相关。尽管向外释放DNA损伤和损伤抗性的关系还没有详细的研究，但是向外排除损伤是修复碱基损伤的一种有效的机制，也代表一种存活策略，可能有两方面的作用：其一、向外排除损伤核苷酸可以减少突变水平，阻止损伤的碱基在随后的合成中再次利用；其二、向外排除碱基是协调DNA修复信号的一个环节。耐辐射奇球菌中有多种UvrA同源蛋白，其中的某些UvrA蛋白除能识别DNA损伤外，也许还参与了损伤核苷酸的排出。

▪锰含量和蛋白质氧化

Daly等研究了高浓度Mn(Ⅱ)的作用，发现Mn的聚集可以增强D.radiodurans的抗辐射能力。当D. radiodurans处于缺乏Mn的培养条件下时，它们的抗离子辐射能力也就下降。不论是否有Mn的存在，该菌在特定辐射剂量下形成的DNA双链断裂数是相同的，因此Mn并不能阻止DNA损伤。但Mn存在时，该菌种更能忍受高辐射剂量导致的细胞损伤。

大多数辐射产生的DNA损伤是活性氧的产生导致的。细胞内的Mn通过清除活性氧来实现保护作用。例如，乳杆菌（Lactobacillus plantarum）缺少过氧化物岐化酶的保护酶，取而代之的是细胞内20-25mM浓度的Mn离子。由于D. radiodurans的双链断裂似乎并不受Mn的影响，因而活性氧的清除一定是保护大分子而不是DNA，猜想Mn离子的富集阻止了过氧化物并和辐射蛋白损伤活性氧产生有关。如果存在这种情况，那么没有聚集足够Mn离子的细菌可能死于离子辐射引起先于DNA损伤的蛋白损伤。已通过实验证实，Mn的确可以保护蛋白免受自由基的攻击。经辐照处理后，基于小分子Mn(2+)的抗氧化保护机制保持了DNA修复和复制蛋白高效性。

除此之外，Mn离子浓度的增加可以提高D. radiodurans基因组的浓度。当在生物体DNA溶液环境中加入多价阳离子时，DNA就会被浓缩，这是因为阳离子中和了骨架中磷酸基团相斥的部分。

▪特有的DNA保护和修复因子

经历电离辐射的细胞内反应是非常复杂的。电离辐射可诱导产生多种类型的DNA 损伤，包括双链断裂（DSB）、单双链断裂（SSB）、DNA-蛋白交联和不同类型的碱基损坏等。细菌的DNA 修复包括一些部分冗余的途径，被认为是一种适应。耐辐射奇球菌拥有全套的细菌DNA 修复系统如碱基切除修复、核苷酸切除修复、碱基错配修复和同源重组修复等。许多科学家认为耐辐射奇球菌极强的抗辐射能力与其本身具有完善而高效的DNA修复系统有关。但在耐辐射奇球菌中是否存在SOS 反应和非同源末端重组(NHEJ)，一直是研究人员所疑惑的。至今尚未有确凿的证据来证明这两条途径对耐辐射奇球菌的抗性有作用。

利用基因组学和蛋白组学，筛选到了一批辐照和干燥处理后被大量诱导表达基因，其中一部分为功能未知的特有基因，如ddrA、ddrB、ddrC、ddrD和pprA等。现在探明一些重要未知基因的功能。DdrA蛋白具有末端保护的功能，结合在DNA单链的3’端的，防止它们被核酸酶的降解。通过对断裂DNA末端的保护，细胞能够保护基因组DNA 直到环境适合细胞的生长和DNA 的修复。ddrA突变株在营养丰富的基质中培养的细胞辐射敏感性只有略微的提高。而如果将细胞辐射后使其处于饥饿状态，那在五天之后其生存能力只为野生型的1/100。DdrB蛋白有具有和DdrA蛋白类似却不同的保护机制。而PprA蛋白被认为能在体外促进DNA双链断裂的连接。这些蛋白可能对该细菌的超强抗性均具有重要贡献。

在耐辐射奇球菌中新发现了一个能够促进DNA损伤修复的多效开关因子PprI。该蛋白突变株对电离辐射、紫外线辐射和丝裂霉素C等DNA损伤介质均极其敏感。可以在DNA损伤后激活recA、pprA与其他DNA修复基因的转录与翻译，并可以大幅度地提高过氧化氢酶的活性，启动了包括了胁迫响应途径、转录翻译途径、能量和物质代谢途径、抗氧化途径等在内的DNA损伤响应和细胞生存网络，是耐辐射奇球菌抗辐射必需的。因此，在该菌中存在着别具一格的DNA损伤响应机制，使得其具有非凡的NA修复能力和耐辐射抗性。

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