荧光测定法

化工领域术语

荧光测定法是将硫胺素氧化为硫色素并测定其荧光值以此计算提取物中硫胺素的含量。荧光强度与硫胺素的含量成正比。

简介

配备有窄透光度范围的滤光片，其输入滤光片最大波长约为365nm，输出滤光片的最大波长约为435nm。

玻璃色谱管〔全长275mm，容量约60ml〕。由下述三部分熔接而成，大致尺寸〔内径〕如下：

顶部：盛液器长95mm直径30mm，收缩至中间部分。

中间部分：吸附管长145mm直径6mm。收缩至下部。

下部：管子拉伸为毛细管，长35mm，直径为当管子充满时其流速＜1ml/min。

所用原料

色谱树脂

加300ml 2N HCl至50g Bio-Rex70〔H型〕中。搅拌15min，倾出并重复操作。加300ml H2O，搅拌1min，倾出并重复至H2O的pH4.5－7.0。使沉降15s，H2O中应无悬浮树脂。如并非如此，重复H2O洗至澄清。

2N醋酸钠溶液

溶解272gNaOAc·3H2O于足够量的H2O中使成1L。

溴甲酚绿指示剂

将0.1g指示剂在玛瑙研钵中与2.8ml 0.05N NaOH研磨溶解，用H2O稀释至200ml。

酶溶液10%

溶解10g高氏淀粉酶于H2O中，并稀释至100ml。每天新鲜配制。

氯化钾溶液

25%(w/v)，溶解250g KCl于足够量的H2O中使其成1L。

酸式氯化钾溶液

加8.5ml HCl至1L中性KCl溶液中。

铁氰化钾溶液

1%，溶解1g K3Fe(CN)6于足够量H2O中，并稀释至100ml。每天新鲜制备。

氧化剂

将4.0ml 1%K3Fe(CN)6溶液与足量的15%NaOH溶液混合使其成100ml。制备后4h内使用该试剂。

异丁醇

在全玻璃仪器中蒸馏。

硫酸奎宁贮备液

用硫酸奎宁液检查荧光计的再现性。将10mg硫酸奎宁溶解在足量的0.1N H2SO4中使成1L。贮备液贮存于红色或琥珀色瓶中。

硫酸奎宁标准液

用足量的0.1N H2SO4稀释5.0ml硫酸奎宁贮备液使成200ml。该液的荧光强度约与从1μg硫胺素得到的硫色素的异丁醇提取液的荧光强度相同。该液贮存于红色或琥珀色瓶中。

酸化乙醇

20%(w/v)。将250ml乙醇用H2O稀释使成1L。滴加HCl调节pH至3.5－4.3。

m 醋酸

3%，用H2O稀释30ml冰醋酸至1L。

色谱管制备

按下述方法制备色谱管：借助玻璃棒将细的玻璃棉塞置于毛细管的上端。仔细地将盛液器壁上的树脂洗下来，加水悬浮1.0－2.0g树脂至吸附管中，吸附过程中保持树脂表面上的液层，以使吸附管与空气隔绝。将充满水〔防止夹杂空气〕的橡皮帽置于毛细管的底端以防色谱管流干。

标准液制备

标准贮备液

100μg/ml。精确称取50mg USP盐酸硫胺素参比标准〔预先贮存于P2O5干燥器中干燥〕品，由于参比标准易吸湿，在称量过程中应采取措施避免吸收水分。将50.0mg标准移至500ml容量瓶中，溶于酸化的20%乙醇中，再用酸化乙醇稀释至500.0ml。置于红色或琥珀色玻塞瓶中于冰箱中保存。溶液可稳定数月。

标准工作液

3μg/ml。将3.0ml标准贮备液用0.1N HCl稀释使成100ml。每天新鲜制备。

样品制备

将固体物充分分散在液体中，如产生结块，猛烈振摇以使所有颗粒与液体接触，在95－100℃蒸汽浴或沸水浴中，在频繁混合下消化30min，或在121℃高压加热混合物30min。$$冷却，如产生结块，搅拌混合物直至颗粒充分分散。

酶水解

分别将冷的样品和标准提取液定量转移至100ml容量瓶中，用约5ml 2N NaOAc溶液调节各溶液和pH至4.0－4.5。〔用溴甲酚绿指示剂在试板上检查〕。加5ml酶溶液，混匀，在45－50℃培养3h，冷却，用0.1N HCl稀释至100ml，用已知不吸附硫胺素的滤纸过滤〔无灰滤纸是适宜的〕。

净化

分别将10ml过滤过的标准和样品溶液〔约含1.5μg盐酸硫胺素〕通过制备的色谱柱。用每份5ml近沸的H2O洗涤每根管3次。注意：要避免液面降至树脂表面以下。$$将5份4.0－4.5ml近沸的酸性KCl溶液通过每根柱子，从树脂上洗脱硫胺素。在加入最后1份酸性KCl溶液前，注意，要避免液面降至树脂表面以下。将标准水解和净化后获得的洗脱液收集在25ml容量瓶中，冷却并用酸性KCl溶液稀释定容。指定该液为标准液。将样品水解和净化后获得的洗脱液收集在25ml容量瓶中，冷却并用酸性KCl溶液稀释定容。指定该液为测定液。

氧化硫胺素

为硫色素

结果的精密度和准确度取决于下述氧化步骤处理中技术的一致：$$分别向4个或4个以上40ml试管或反应容器中，加入1.5g NaCl或KCl以及5ml标准溶液〔硫色素是光敏物质，该溶液应避光〕。$$用在1－2s内能放出3ml的移液管，将已吸取氧化剂的移液管的尖头置于试管管颈处，握住它使氧化剂液流不碰击管壁。缓慢摇动试管使液体产生旋转运动并立即加入3ml氧化剂。移去移液管，再摇动试管确保混匀，放置9.0ml，立即加入13ml重蒸馏的异丁醇。塞上管塞，猛烈振摇15s。同样处理1个或1个以上另外的试管。除了以3ml 15% NaOH代替氧化剂外，以同样的方法分别处理2个或2个以上剩余的试管〔标准空白〕。$$分别于4个或4个以上相似的试管中，加入5ml测定液，按照含标准液试管〔包括加1.5gNaCl或KCl〕的所说的同样方法处理这些管子。$$各管加入异丁醇后再振摇约2min，低速离心直至得到澄清的上层液，分别从各管吸取或倾析出约10ml异丁醇提取液〔上层〕至比色池，测定硫色素的荧光值。

测定

硫色素荧光值的测定

测定从氧化测试液来的异丁醇提取液的荧光值，称该读数为“U”。测定用3ml 15% NaOH溶液处理过的测试提取液〔测定空白〕的荧光值，称该读数为“b”，测定用3ml 15% NaOH溶液处理过的标准液提取液的荧光值〔标准空白〕，称该读数为“d”。$$盐酸硫胺素mg/L喂饲食品=[〔U－b〕/〔S－d〕]$$×[15/(A×1000)]×R$$式中U=测试样品的读数；b=测试样品空白的读数；S=标准样品的读数；d=标准样品空白的读数；R=使成1L喂饲食品配方所需样样的重新组成值，以重量或容量表示；A=样品量，以g或ml表示。

注释和注意点

硫色素在异丁醇溶液中是稳定的，但需要立即读数，通常在20min内不改变结果〔只要溶液不暴露在强日光下〕。$$两份平行样品通过测定步骤，得到的值应在平均值的±2.5%以内。在不同日期测定同类样品应在平均值的±5%以内。$$在读取样品硫色素荧光值中间，用奎宁工作液校对荧光光度计。

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