葡萄籽提取物

从葡萄籽中提取分离得到的一类多酚类物质

葡萄籽提取物是从葡萄籽中提取分离得到的一类多酚类物质，主要由原花青素、儿茶素、表儿茶素、没食子酸、表儿茶素没食子酸酯等多酚类物质组成。

特性

抗氧化能力

葡萄籽提取物是纯天然物质，是迄今发现的植物来源最高效的抗氧化剂之一，试验表明，其抗氧化效果是维生素C和维生素E的30～50倍。

活性

原花青素具有极强的活性，能抑制香烟中的致癌物，在水相中对自由基的捕捉能力是一般抗氧化剂的2～7倍，如比α-生育酚的活性高两倍以上。

提取

研究发现，在众多的植物组织中，葡萄籽与松树皮提取物中原花青素的含量最高，而从葡萄籽中提取原花青素的方法主要有溶剂提取法、微波浸提法、超声提取法和超临界CO2萃取法等。葡萄籽原花青素提取物中含有很多杂质，需进一步纯化才能提高原花青素的纯度，常用的纯化方法有溶剂萃取、膜过滤及色谱法。

乙醇浓度对葡萄籽原花青素提取率的影响最为显著，提取时间和温度对葡萄籽原花青素提取率的影响都不显著。其最佳提取工艺参数为：乙醇浓度70%，提取时间120min，料液比1 : 20。

静态吸附实验表明HPD- 700对原花青素的吸附率最高为82.85%，其次为DA201，为82.68%，其差值相差不大，而且，这两种树脂对原花青素的吸附量也相同。在解吸试验中，DA201树脂对原花青素的解吸率最高，为60.58%，而HPD- 700对原花青素的解吸率只有50.83%。结合吸附试验和解吸实验，确定DA210树脂为分离原花青素的最佳吸附树脂。

通过工艺优化，在原花青素浓度为0.15mg/mL时，流速为1mL/min，以70%的乙醇溶液作为洗脱剂，流速为1mL/min，洗脱剂用量为5BV，可以对葡萄籽原花青素的提取液进行初步纯化。

有效成分测定

Bate-Smith法

此法测定的是葡萄籽提取物中的原花青素，其含量用原花青素指数来表示。由于没有原花青素的标准品，因此此方法测定的只是葡萄籽提取物中原花青素的相对值。

原理

原花青素在酸性条件下加热转化为红色的花青素。

操作程序

称取适量的葡萄籽提取物（约15~ 40mg）用甲醇溶解, 最后定溶于100mL。从中取1mL样品溶液加到10mL比色管中，然后再加入6mL盐酸- 正丁醇溶液（5/95，V/V），在97℃下反应40min后，取出迅速冷却，在550nm处测定其吸光度，以甲醇代替提取物溶液作为空白。

原花青素指数 = A × 7.0/W。A：吸光度；W：样品质量（g）。

由于用Bate-Smith法测得的葡萄籽提取物中原花青素指数一般在80~100之间，有时也可能大于100。

Porter法

由于Bate-Smith法测定的结果重现性很差，并且原花青素在此条件下反应不是很彻底。因此Porter等人对Bate- Smith法进行了改进。Porter法改进之处主要是在试剂中添加了Fe3+，以提高反应的程度和颜色的稳定性。此方法测定的也是原花青素的相对含量，结果用PVU（porter value unit）表示。porter法的原理同Bate- Smith法。

操作程序

称取适量的葡萄籽提取物（约10~ 30mg）用甲醇溶解，最后定溶于100mL。从中取1mL样品溶液加到10mL比色管中，然后依次加入6mL盐酸-正丁醇（5/95，V/V），0.2mL 2.0%硫酸铁铵溶液（用2mol.L-1的盐酸溶解），在97℃下反应40min后，取出迅速冷却，在550nm处测定其吸光度，以甲醇代替提取物溶液作为空白。

PVU = A × 7.2/W。A：吸光度；W：样品质量（g）。

美国葡萄籽方法评定委员会认为葡萄籽提取物的PVU在250~ 350之间是比较理想的。PVU过低，可能说明该产品中原花青素的含量较低；PVU过高，说明该产品中高聚体原花青素含量较高。但由于porter法不能区分测出的是何种原花青素，所以若一种葡萄籽提取物测出的PVU为300，则该产品可能是低聚体原花青素含量较多，也可能是单体和高聚体原花青素含量较多。

美国葡萄籽方法评定委员会认为上述两种方法不能作为葡萄籽提取物中总多酚或原花青素的定量分析方法。

Folin- Ciocalteau法

此法测定的是葡萄籽提取物中总多酚的含量，一般以没食子酸作为对照品。此方法的优点是能定量分析提取物中总多酚的含量。缺点是不能区分多酚的种类（例如测定的是单体，还是聚合体）；另外蛋白质、核酸、抗坏血酸等易被氧化的物质也参与此反应，不能辨别葡萄籽提取物是否搀假。由于单体和原花青素反应的系数（factors）不一样，所以测定的含量和葡萄籽提取物中的真实含量有一定偏差。

原理

在碱性溶液中，酚类化合物可以将钨钼酸还原（W6+变为W5+），生成蓝色的化合物，颜色的深浅与多酚含量呈正相关，蓝色化合物在760nm处有最大吸收峰。

操作程序

称取适量的葡萄籽提取物，用水溶解，浓度在0.1mg/mL左右。取1mL样品液加到10mL比色管中，然后依次加入1mL去离子水、0.5mL Folin- Ciocalteau试剂、1.5mL 26.7% Na2CO3溶液，最后用水定容至10mL，室温下反应2小时，在760nm下测定其吸光度。

以没食子酸作为对照品，配制不同浓度的溶液，按上述方法反应，测得吸光度。以吸光度对浓度绘制标准曲线。由标准曲线可求得提取物中总多酚的含量（以相当于没食子酸的含量表示）。

美国葡萄籽方法评定委员会同意采用此种方法来测定葡萄籽提取物中的总多酚，但同时建议此方法还需进一步完善，以确认单体和原花青素同Folin- Ciocalteau试剂反应的差异。

香兰素检测法

此法测定的是葡萄籽提取物中黄烷-3-醇的含量，但不能区分其中的单体和聚合体。一般用儿茶素作标准品去定量测定。

原理

在酸性条件下，间苯三酚、间苯二酚、A环的黄烷醇和聚原花青素A环的化学活性较高，其上的间苯三酚或间苯二酚可与香兰素发生缩合，产物在酸作用下形成有色的正碳离子，样品的浓度与产生的颜色呈正相关。

操作程序

称取适量的葡萄籽提取物用一定体积的甲醇溶解，最后葡萄籽提取物溶液的浓度为0.1mg/mL左右。取样品溶液1mL加到10mL比色管中，然后依次加入2.5mL香兰素甲醇溶液（1.0% W/V），2.5mL 25%硫酸甲醇溶液。室温下反应15min，在510nm测定其吸光度。

以儿茶素作为对照品，配制不同浓度的溶液，按上述方法反应，测得吸光度，以吸光度对浓度绘制标准曲线。由标准曲线可求得提取物中黄烷-3-醇的含量。

香兰素检测法测定葡萄籽提取物中黄烷-3-醇一般是用甲醇溶解提取物，配制试剂。另外也可用冰醋酸溶解提取物，配制试剂，但二者测定的数据有很大差异。用甲醇作溶剂时，香兰素法测定的是总黄烷-3-醇的量，对于聚合原花青素中所有的黄烷-3-醇的量都能发生此反应。而用冰醋酸用溶剂时，香兰素法测定的是单体黄烷-3-醇和聚合原花青素末端黄烷-3-醇的量，而聚合原花青素中间的黄烷-3-醇不能被测出。而大多用甲醇作溶剂来测定葡萄籽提取物中黄烷-3-醇的量。同时采用两种溶剂可大概测出提取物中原花青素的平均聚合度。

美国葡萄籽方法评定委员会已经同意不采用此方法来检测葡萄籽提取物中的有效成分。

HPLC法

此法测定的是提取物中每种单体、低聚体、高聚体的含量。但由于对照品的限制以及分析手段的制约，只能测定葡萄籽提取物中单体和某些低聚体的含量。实际应用中只需测定其中的单体含量即可。葡萄籽提取物中主要的单体为儿茶素、表儿茶素、没食子酸、表儿茶素没食子酸酯。

葡萄籽提取物中单体的含量一般在10.0%左右，最高可达到30.0%。由于葡萄籽提取物成分的复杂性，若样品未经预处理，HPLC法一般很难把多种单体完全分离开来。所以进样前，需对提取物进行预处理，以去除其中的高聚体，提高单体的含量。常用的预处理方法有：硅胶柱层析、SephadexLH- 20、Sephadex G25、Toyopeah TSK HW40等柱层析方法。也可采用薄层层析法对样品进行预处理，一般用甲苯 : 丙酮 : 乙酸 = 3 : 3 : 1（V/V/V）作展开剂。

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